中藥新穿心蓮內(nèi)酯抗中暑內(nèi)毒素血癥作用機(jī)制的研究.pdf

1、目的：本研究通過(guò)建立中暑內(nèi)毒素血癥動(dòng)物模型，從新穿心蓮內(nèi)酯治療中暑的藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)入手，觀察它對(duì)中暑內(nèi)毒素血癥的治療效果；并建立中暑內(nèi)毒素血癥的細(xì)胞模型，探討新穿心蓮內(nèi)酯對(duì)中暑內(nèi)毒素血癥的作用及其可能的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制，為其在防治中暑內(nèi)毒素血癥中的應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。 方法：實(shí)驗(yàn)分為兩個(gè)部分。第一部分：新穿心蓮內(nèi)酯在中暑內(nèi)毒素血癥小鼠中的作用。昆明小鼠隨機(jī)分為高溫組、生理鹽水組、地塞米松組、DMSO（二甲基亞砜組和新穿心蓮內(nèi)酯組（按小鼠體

2、重腹腔注射給藥），新穿心蓮內(nèi)酯組按5mg/kg體重腹腔注射給藥，地塞米松組按5mg/kg體重腹腔注射給藥，生理鹽水組給予劑量同新穿心蓮內(nèi)酯組。第二部分：新穿心蓮內(nèi)酯抗中暑內(nèi)毒素血癥信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制的研究。本課題模擬動(dòng)物中暑內(nèi)毒素血癥模型，從離體細(xì)胞實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探討新穿心蓮內(nèi)酯治療中暑的作用機(jī)制。選用小鼠來(lái)源的單核巨噬細(xì)胞系RAW264.7細(xì)胞做為主要研究對(duì)象，以內(nèi)毒素（終濃度0.1μg/ml）作為主要刺激因素建立內(nèi)毒素血癥模型。 結(jié)果

3、：第一部分：新穿心蓮內(nèi)酯在中暑內(nèi)毒素血癥小鼠中的作用。 1.應(yīng)用新穿心蓮內(nèi)酯后中暑小鼠生理指標(biāo)變化①各組小鼠肛溫上升速率的變化：新穿心蓮內(nèi)酯組5mg/kg組和穿心蓮內(nèi)酯組（5mg/kg）肛溫上升速率低于DMSO對(duì)照組、地塞米松組、生理鹽水組和高溫對(duì)照組（P<0.05），數(shù)據(jù)分別為：0.044±0.001℃/min、0.043±0.001℃/min、0.066±0.004℃/min、0.057±0.003℃/min、0.052±0

4、.001℃/min、0.055±0.003℃/min，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；②各組小鼠生存時(shí)間的變化：新穿心蓮內(nèi)酯5mg/kg組和穿心蓮內(nèi)酯組（5mg/kg）生存時(shí)間明顯長(zhǎng)于DMSO對(duì)照組、地塞米松組、生理鹽水組和高溫對(duì)照組（P<0.05），數(shù)據(jù)分別為：120.0±3.71min、112.5±4.28 min、87.8±3.89min、92.1±6.10 min、95.8±4.59 min、97±3.22 min；且新穿心

5、蓮內(nèi)酯5mg/kg組的生存時(shí)間長(zhǎng)于穿心蓮內(nèi)酯組，其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P<0.05。 2.血漿中內(nèi)毒素含量變化熱暴露2h后，地塞米松組、生理鹽水組和高溫對(duì)組小鼠血漿內(nèi)毒素含量分別為0.210±0.008ng/ml0.234±0.013ng/ml和0.259±0.014ng/ml，較正常對(duì)照組0.104±0.004ng/ml明顯升高（P<0.05）；新穿心蓮內(nèi)酯組小鼠血漿內(nèi)毒素含量為0.132±0.003ng/ml，略高于正常對(duì)照組

6、，二者無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。 3.病理組織切片觀察①大體標(biāo)本觀察：對(duì)照組肺組織顏色均勻，呈粉紅色，柔軟，彈性好。高溫對(duì)照組肺臟體積增大，可見(jiàn)彌漫和大片的出血和實(shí)變區(qū)。新穿心蓮內(nèi)酯組5mg/kg組肺組織出血較高溫對(duì)照組明顯減輕。光鏡觀察：對(duì)照組肺組織結(jié)構(gòu)清楚，肺泡內(nèi)無(wú)白細(xì)胞和紅細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡壁薄，肺泡內(nèi)未見(jiàn)水腫液。高溫對(duì)照組肺泡間隔增厚，中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，部分肺泡結(jié)構(gòu)破壞，肺內(nèi)大量中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)伴出血、水腫。新穿心蓮內(nèi)酯（5

7、mg/kg）組肺泡結(jié)構(gòu)存在，肺泡間隔增厚及中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減輕，肺間質(zhì)見(jiàn)滲出液和少量紅細(xì)胞，肺泡腔可見(jiàn)少量紅細(xì)胞；②肝組織光鏡照片觀察到，高溫對(duì)照組、地塞米松組和生理鹽水組肝組織大量充血，中央靜脈擴(kuò)張，可見(jiàn)大量空泡；而新穿心蓮內(nèi)酯（5mg/kg）組肝組織僅見(jiàn)少量的充血和胞核腫脹，未見(jiàn)空泡，與正常對(duì)照組相近。 第二部分：新穿心蓮內(nèi)酯拮抗中暑內(nèi)毒素血癥機(jī)制的研究。 1.MTT法檢測(cè)細(xì)胞生存活力的變化（以下各組均將正常對(duì)照組

8、的生存率定為100%）①給予LPS（濃度為分別為0.1、1、10、20、40μg/ml）培養(yǎng)24h后，其中0.1μg/ml組細(xì)胞存活力為33.57±7.17%，1、10、20、40μg/ml組的生存活力分別為37.23±8.24%、42.39±10.5%、43.23±5.25%、51.20±15.7%，其中0.1pg/ml與正常對(duì)照組和其他濃度組比均低，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）；②給予新穿心蓮內(nèi)酯（濃度分別為3.0、4.5、7.5

9、、11.25、15、30、60μmol/L）培養(yǎng)24h后，生存力分別為112.5±6.55%、125.1±7.21%、132.9±8.89%、143.6±5.75%、113±4.44%、102.7±4.77%、42.66±8.936%，可以看出，當(dāng)藥物濃度大于60μmol/L的時(shí)候，對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)有明顯的抑制作用，在濃度小于60μmol/L的時(shí)候，藥物對(duì)細(xì)胞沒(méi)有毒性作用，而其中當(dāng)新穿心蓮內(nèi)酯濃度為11.25μmol/L時(shí)，對(duì)細(xì)胞的保護(hù)作用

10、最顯著；③根據(jù)以上結(jié)果，確定細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，LPS的終濃度為0.1μg/ml，新穿心蓮內(nèi)酯的有效保護(hù)濃度設(shè)定為3.0、7.5、11.25、15、30μmol/L。細(xì)胞在LPS終濃度為0.1μg/ml的培養(yǎng)基中培養(yǎng)4h后，分別分組加入新穿心蓮內(nèi)酯3.0、4.5、7.5、11.25、15、30μmol/L，培養(yǎng)24h后，生存力分別為61.28±1.25%、73.25±1.95%、84.71±3.74%、88.93±6.52%、72.77±2.1

11、5%、69.8±1.85%，內(nèi)毒素對(duì)照組存活力為50.06±0.87%。可以看出，當(dāng)新穿心蓮內(nèi)酯濃度為11.25μmol/L時(shí)，對(duì)細(xì)胞保護(hù)能力最強(qiáng)，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）。因此選擇3.0、7.5、11.25、15、30μmol/L五個(gè)有效濃度用于下一步實(shí)驗(yàn)。 2.信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子TLR4 mRNA表達(dá)變化①細(xì)胞在內(nèi)毒素終濃度分別為0、0.1、1、10μg/ml的條件下培養(yǎng)24h后，TLR4 mRNA的表達(dá)量各不相同。其中0.

12、1μg/ml組的表達(dá)量最高，與其他組比有明顯差異，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；②細(xì)胞在新穿心蓮內(nèi)酯終濃度分別為0、3.0、7.5、11.25μmol/L的條件下培養(yǎng)24h后，TLR4 mRNA的表達(dá)量各不相同。其中11.25μmol/L組的表達(dá)量明顯低于其他組，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；③在內(nèi)毒素終濃度為0.1μg/ml的條件下培養(yǎng)4h后加入新穿心蓮內(nèi)酯（3.0、7.5、11.25、15、30μmol/L）培養(yǎng)24hTLR

13、4 mRNA的表達(dá)量各不相同，與內(nèi)毒素0.1μg/ml組相比，新穿心蓮內(nèi)酯11.25μmol/L明顯抑制了TLR4 mRNA的表達(dá)，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 3.信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子NF-KB（p50）mRNA的表達(dá)變化①細(xì)胞在內(nèi)毒素終濃度分別為0、0.1、1、10μg/ml的條件下培養(yǎng)24h后，NF-KB（p50）mRNA的表達(dá)量各不相同。其中0.1μg/ml組的表達(dá)量最高，與其他組比有明顯差異，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；②細(xì)胞在新

14、穿心蓮內(nèi)酯終濃度分別為0、3.0、7.5、11.25μmol/L的條件下培養(yǎng)24h后，NF-KB（p50）mRNA的表達(dá)量各不相同。其中11.25μmol/L組的表達(dá)量明顯低于其他組，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；③在內(nèi)毒素終濃度為0.1μg/ml的條件下培養(yǎng)4h后加入新穿心蓮內(nèi)酯（3.0、7.5、11.25、15、30μmol/L）培養(yǎng)24hNF-KB（p50）mRNA的表達(dá)量各不相同，與內(nèi)毒素0.1μg/ml組相比，新穿心蓮內(nèi)酯

15、11.25μmol/L明顯抑制了NF-KB（p50）mRNA的表達(dá)，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）。 4.細(xì)胞因子TNF-α表達(dá)的變化在內(nèi)毒素終濃度為0.1μg/ml的條件下培養(yǎng)4h后加入新穿心蓮內(nèi)酯（3.0、7.5、11.25、15、30μmol/L）再培養(yǎng)24h后細(xì)胞懸液中TNF-α的表達(dá)量各不相同，與內(nèi)毒素0.1μg/ml組相比，新穿心蓮內(nèi)酯11.25μmol/L明顯減少了細(xì)胞懸液中TNF-α含量，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<

16、0.05）。 結(jié)論: 1.新穿心蓮內(nèi)酯是一種治療中暑內(nèi)毒素血癥的有效藥物，它能減緩中暑小鼠肛溫上升速率、延長(zhǎng)生存時(shí)間；并能夠顯著降低中暑小鼠血中內(nèi)毒素含量，同時(shí)減輕肝臟、肺臟等重要臟器病理?yè)p傷，對(duì)中暑小鼠機(jī)體具有良好的保護(hù)作用。 2.RAW264.7細(xì)胞在不同濃度的內(nèi)毒素培養(yǎng)條件下，細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子TLR4mRNA、NF-KB mRNA的表達(dá)量不同，均較正常組升高。但在新穿心蓮內(nèi)酯的作用下，上述倆種因子mRNA的表

17、達(dá)明顯下降。說(shuō)明新穿心蓮內(nèi)酯可以有效的抑制由于內(nèi)毒素引起的TLR4 mRNA、NF-KB mRNA的表達(dá)上調(diào)。這是此藥物發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)的重要機(jī)制。 3.RAW264.7細(xì)胞在不同濃度的內(nèi)毒素培養(yǎng)條件下，細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子TNF-α的表達(dá)量不同，均較正常組升高。但在新穿心蓮內(nèi)酯的作用下，TNF-α的表達(dá)量明顯下降。說(shuō)明新穿心蓮內(nèi)酯可以有效的抑制由于內(nèi)毒素引起的TNF-α的表達(dá)量上調(diào)。這是此藥物發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)的重要機(jī)制。這可能和新穿心