鉤端螺旋體LA2144基因產(chǎn)物血小板活化因子乙酰水解酶活性的研究.pdf

1、目的:確定問號鉤端螺旋體（簡稱鉤體）LA2144基因產(chǎn)物血小板活化因子乙酰水解酶活性(PAF-AH)、感染細胞時表達與分泌情況，以及誘導金地鼠內(nèi)臟出血的作用。
　　方法:采用PCR擴增問號鉤體黃疸出血群賴型賴株無信號肽LA2144基因并構建其原核表達系統(tǒng)，采用Ni-NTA親和層析法提純表達的目的重組蛋白rLep-PAF-AH。采用分光光度法檢測rLep-PAF-AH水解PAF底物的活性、水解效率及Km和Kcat值。采用實時熒光定量

2、RT-PCR(qRT-PCR)和Western Blot法分別檢測問號鉤體賴株感染人臍靜脈內(nèi)皮細胞HUVEC、人單核細胞THP-1和小鼠巨噬細胞J774A.1后，LA2144基因mRNA(Lep-PAF-AH-mRNA)水平變化及產(chǎn)物外分泌情況。金地鼠尾靜脈兩次注射100μg無LPS的rLep-PAF-AH后觀察肺、肝、腎組織中出血情況。
　　結(jié)果:所構建的問號鉤體賴株LA2144基因原核表達系統(tǒng)在IPTG誘導下能高效表達rLep

3、-PAF-AH，Ni-NTA親和層析法提純的rLep-PAF-AH經(jīng)SDS-PAGE后顯示為單一的蛋白條帶。5μg rLep-PAF-AH對底物的水解效率為26.6 U/L，其Km和Kcat值分別為82.79μmol/L和0.24 S-1。問號鉤體賴株與HUVEC、THP-1和J774A.1細胞共培養(yǎng)1或2 h，Lep-PAF-AH-mRNA水平顯著升高(p＜0.05)。問號鉤體賴株與上述細胞共培養(yǎng)2～12h，培養(yǎng)物上清中檢出大量Lep