重組人血小板活化因子乙酰水解酶治療腦梗塞的實驗研究.pdf

1、背景和目的:腦血管病是臨床的常見病，其發(fā)病率高、死亡率高、致殘率高，嚴重危害人類健康。其中，缺血性腦血管病的發(fā)病占70％，多見于60歲以上的老年患者。隨著老齡化社會的到來，腦血管病帶來的經(jīng)濟和社會負擔嚴重影響了我國老年人的健康狀況和生活質(zhì)量。因此，尋找高效而安全的藥物已成為我們實驗研究的重點。
　　 一旦腦缺血超過6分鐘，即可引發(fā)腦組織能量的耗竭，信號傳導(dǎo)發(fā)生異常，從而導(dǎo)致線粒體功能障礙，大腦的神經(jīng)功能進行性的不可逆性的全面損傷

2、。當腦缺血再恢復(fù)血流供應(yīng)時，器官組織的細胞功能、代謝障礙及結(jié)構(gòu)破壞不但沒有得到恢復(fù)反而加重的現(xiàn)象，稱為再灌注損傷。缺血性腦血管疾病的發(fā)病機制比較復(fù)雜，目前研究的藥物主要有:興奮性氨基酸受體拮抗劑、鈣離子拮抗劑和自由基清除劑等，但其治療急性缺血性腦卒中的效果仍不能完全肯定。第一個治療該病的溶栓藥t-PA于1996年被美國FDA批準并逐漸成為目前公認的有效方法。但溶栓治療限于嚴格的時間窗和診療條件，僅2％-5％的卒中患者能進行該項治療;同時

3、溶栓治療雖可通過血流再灌注改善腦缺血區(qū)的神經(jīng)細胞功能，但對于缺血所引起的腦組織再灌注損傷束手無策。而對各種類型腦保護劑的研究表明，很多藥物臨床療效欠佳，或有較嚴重副作用。由此可見，深入研究腦血管病的發(fā)病機制，進而開發(fā)出有效的抗缺血性腦損傷藥物，已經(jīng)成為當代神經(jīng)病學研究迫切需要解決的課題之一。
　　 血栓形成是缺血性腦血管病的主要致病因素。血小板在血栓的發(fā)病中有十分重要的作用，因此抑制血小板活化已經(jīng)成為治療腦卒中的常規(guī)療法。研究表

4、明，腦缺血時，血小板功能異常亢進使血液處于高凝狀態(tài)，這是造成繼發(fā)性腦損傷的重要原因之一。目前臨床上廣泛使用抗血小板藥物預(yù)防高危人群中腦卒中的發(fā)生，從而有效降低缺血性腦卒中的發(fā)生率。因此，針對血小板的粘附和聚集被認為是開發(fā)抗栓藥物非常有前景的靶點。目前已有的抗血小板藥物按其作用機理大體可分為四類:(1)特異性抑制二磷酸腺苷(Adenosinediphosphate，ADP)活化血小板的藥物:Ticlopidine和Clopidogrel，

5、選擇性抑制ADP活化的血小板聚集;(2)增高血小板內(nèi)環(huán)核苷酸含量的藥物，如西洛他唑和雙密達莫;(3)抑制血小板花生四烯酸(Arachidonicacid，AA)代謝的藥物，包括環(huán)氧酶抑制劑（阿司匹林）和血栓素A2(ThromboxaneA2，TXA2)合成酶抑制劑（苯酸咪哇），通過抑制環(huán)氧酶或TXA2合成酶，阻礙AA衍變?yōu)門XA2;(4)血小板膜纖維蛋白原受體拮抗劑，如Abciximab，通過阻斷纖維蛋白原與血小板受體GPⅡb/Ⅱla的

6、結(jié)合而有效地抑制血小板聚集。
　　 血小板活化因子(platelet-activatingfactor，PAF)是磷脂類生物活性介質(zhì)及細胞因子并日益受到重視。它在極低濃度下通過與特異性G蛋白受體結(jié)合而活化多種細胞，介導(dǎo)炎癥和其他疾病，影響消化、心腦血管、生殖、皮膚和呼吸等多種組織系統(tǒng)。大量動物和臨床實驗表明，PAF參與了腦梗塞的發(fā)生發(fā)展病理過程，與動脈粥樣硬化、缺血性腦血管病的轉(zhuǎn)歸密切關(guān)聯(lián)。PAF是最強的誘導(dǎo)血小板聚集劑，一方面

7、，PAF能進一步促進血小板橋聯(lián)作用，啟動血栓形成和機化，此環(huán)節(jié)不受阿司匹林的作用影響;另一方面，與繼發(fā)性缺血性腦損傷有關(guān)，如免疫促炎、促血栓形成及自由基、興奮性氨基酸釋放、鈣超載、即早基因表達等。因此，機體內(nèi)PAF若異常升高，將導(dǎo)致臨床腦梗塞的發(fā)生及繼發(fā)性腦損害。PAF受體拮抗劑可通過抑制血小板聚集和自由基、興奮性氨基酸釋放、鈣超載發(fā)揮梗塞后腦保護作用。早已證實，急性腦梗塞患者血漿和腦梗塞模型鼠腦組織中PAF含量明顯高于對照組。PAF抑

8、制劑的代表-銀杏提取制劑是治療臨床腦梗塞的常用藥物之一。
　　 血管內(nèi)PAF的代謝失活是由于2位乙?；凰?，催化此反應(yīng)的酶即為血漿型PAF乙酰水解酶(platelet-activatingfactoracetylhydrolase，PAF-AH)，故該PAF-AH和PAF的動態(tài)平衡對維持PAF的正?；钚云鹬匾饔?。大多數(shù)炎癥性疾病PAF-AH輕度升高。另外，妊娠、高血壓、血管性疾病、缺血性卒中、尿毒癥、艾滋病等可出現(xiàn)升高現(xiàn)象，

9、而升高的PAF-AH可明顯減輕PAF和氧化磷脂的炎癥介質(zhì)效應(yīng)。因而推測PAF-AH含量及活性的降低與動脈硬化性形成、腦梗塞的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。此外，PAF-AH還可顯著抑制氧化應(yīng)激連鎖反應(yīng)，對血管內(nèi)皮具有保護性作用。
　　 人血漿型PAF-AH主要來源于巨噬細胞，其基因位于6p.12p.21.1，含12個外顯子，可編碼441個氨基酸，分子量為44-kDa。Tjoelker等首次成功建立人血漿型PAF-AHDNA重組體，證實所表達的重

10、組血漿型PAF-AH(rPAF-AH)具有同等催化底物PAF的活性，可抑制PAF誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)，用rPAF-AH尾靜脈注射可顯著減輕胰腺炎模型大鼠胰腺損傷程度，生物半衰期達7小時。而rPAF-AH更可作為預(yù)防呼吸窘迫綜合征和降低敗血癥死亡率的有效手段。多中心、隨機、雙盲、安慰劑對照三期臨床試驗結(jié)果顯示，應(yīng)用rPAF-AH治療敗血癥的患者對rPAF-AH耐受性好、無抗體產(chǎn)生。目前采用rPAF-AH治療疾病的研究集中局限于炎癥反應(yīng)

11、方面，國內(nèi)則尚未見有rPAF-AH相關(guān)文獻報道。
　　 基質(zhì)金屬蛋白酶(matrixmetalloproteases，MMPs)是一種能夠分解細胞外基質(zhì)(ECM)的鋅依賴性蛋白水解酶家族，在人體內(nèi)參與多種生理和病理過程。相對分子質(zhì)量為72x103(72KD)的MMP-2和相對分子質(zhì)量為92x103(92KD)的MMP-9為MMP家族的2個成員，均可降解基底膜的ECM成分，其底物包括Ⅳ型、V型膠原酶、纖維連接蛋白、彈性蛋白和變性的

12、基質(zhì)膠原。正常情況下，MMP-2以潛伏的形式存在于腦組織內(nèi)，可被膜結(jié)合蛋白酶膜型金屬蛋白酶(membranetypematrixmetallo-proteinase,MT-MMp)激活。
　　 近年來，有人發(fā)現(xiàn)腦缺血再灌注后出現(xiàn)MMPs增加，尤其是MMP-9和MMP-2活性增加與腦微血管通透性、血腦屏障(Bloodbrainbarrier,BBB)通透性、BBB崩潰、腦水腫和炎細胞侵入明顯相關(guān)。BBB破壞后，一方面可引起血液中的

13、血漿蛋白、多種毒性物質(zhì)及代謝產(chǎn)物進入腦內(nèi)，促進并加重血管源性腦水腫;另一方面為炎性因子侵入腦組織大開方便之門。在局部腦缺血所致的出血變化時，MMP-9的表達明顯增強，而MMP-2則不增強，提示兩者在降解基底膜引起的神經(jīng)元損傷以及局灶性腦缺血導(dǎo)致出血性轉(zhuǎn)化早期的潛在作用。其中MMP-9(明膠酶B)激活時能降解參與血腦屏障基膜的主要成分纖粘蛋白和粘蛋白，破壞血腦屏障，引起血腦屏障的通透性升高或進一步開放，缺血后腦組織MMP-9活性增高是缺血

14、后腦損傷的重要機制之一。近年來有研究表明，腦缺血再灌注可增強MMP的表達，予MMP抗體或MMP抑制劑可減輕腦缺血再灌注損傷，改善血管源性水腫，以及保護神經(jīng)細胞免受損傷等。
　　 血管內(nèi)皮生長因子(vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)是強效的有絲分裂原，可直接并選擇性地作用于內(nèi)皮細胞，促進新生血管生成。中樞神經(jīng)系統(tǒng)有多種因子可促進血管新生，而許多研究均表明在血管新生過程中，VEGF是主要的因子

15、之一。VEGF可令細胞間的接觸松弛，并使稠密的細胞外基質(zhì)瓦解，進而促進新的微血管形成。VEGF在血管新生中的主要作用包括:①上調(diào)細胞間和血管細胞的粘附分子的水平;②誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞上相應(yīng)受體和配體的表達;③促進血管內(nèi)皮細胞的增殖和遷移;④誘使骨橋鉆合蛋白與上調(diào)的內(nèi)皮細胞表面的整合素受體結(jié)合;⑤增加絲氨酸蛋白酶的活性，從而降解特定區(qū)域的細胞外基質(zhì)，促進血管生成。缺氧或缺血在多數(shù)組織可以引致血管新生。而VEGF在局灶性腦缺血的血管新生中發(fā)揮不可

16、忽視的作用。中樞神經(jīng)缺血后，在梗死灶周圍有一圈缺血相對較輕的區(qū)域，稱半暗帶(penumbra)。半暗帶血供的恢復(fù)對神經(jīng)細胞的存活具有舉足輕重的意義。VEGF基因的啟動子區(qū)含有缺氧誘導(dǎo)因子-1(HIF-1)反應(yīng)元件。當腦部發(fā)生缺氧或低氧時，VEGF基因5’端低氧反應(yīng)元件與HIF-1結(jié)合，啟動環(huán)二磷酸鳥苷酸(cGMP)途徑，VEGF的表達即可受到相應(yīng)調(diào)節(jié)。目前公認缺氧是調(diào)節(jié)VEGF及其受體表達的主要因素之一。腦缺血后，低氧信號激活VEGFN

17、EGF受體系統(tǒng)，促使VEGF在半暗帶區(qū)域高表達。隨即誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞增殖，促進半暗帶大量新生血管形成，加速側(cè)枝循環(huán)的建立，改善相應(yīng)缺血腦組織的供血供氧，減少神經(jīng)元凋亡或壞死，最終減輕缺血性腦損傷。
　　 VEGF對神經(jīng)元的直接作用是神經(jīng)營養(yǎng)作用，可促進體外培養(yǎng)的神經(jīng)元軸突生長、增加神經(jīng)突觸的數(shù)目并延長其長度，提高神經(jīng)元的存活率。正常情況下，腦內(nèi)無VEGF表達，但當受到某種損害時如缺氧炎癥腫瘤時能誘導(dǎo)VEGF表達已被許多體內(nèi)及體外實驗

18、證實。
　　 奧扎格雷鈉為血栓烷(TX)合酶抑制劑，能阻止前列腺素H2(PGH2)生成血栓烷A2（TXA2），并促使血小板所產(chǎn)生的PGH2轉(zhuǎn)向內(nèi)皮細胞，令內(nèi)皮細胞可利用PGH2合成PGI2，從而起到抑制血小板的聚集和擴張血管作用。動物試驗表明，在大腦中動脈阻塞小鼠模型中，靜脈給藥能使其血漿TXB2水平降低，可預(yù)防性治療腦梗塞。
　　 金納多(extractofginkgobilobaleavesinjection)產(chǎn)于德

19、國，為銀杏提取物，作為強效PAF拮抗劑，具有抑制血小板聚集，抗血栓，改善血液動力學與血液流變學，改善心腦代謝及抗炎性損傷等作用。從本世紀20年代起，銀杏葉制劑就用于治療外周及中樞血液循環(huán)障礙以及腦功能障礙等癥。目前，作為銀杏葉提取物的金納多注射液已在亞洲地區(qū)廣泛使用，成為治療腦梗塞的常見藥物。本研究選擇安全有效的金納多注射液和奧扎格雷鈉注射液作為rPAF-AH的陽性對照，希望能對rPAF-AH的神經(jīng)保護作用做出較為全面的評估。
　

20、　 本研究使用美國peprotech公司制作的rPAF-AH，觀察不同濃度rPAF-AH對兔富含血小板血漿PAF誘導(dǎo)的血小板聚集率的影響和量效關(guān)系;另一方面，觀察靜脈注射rPAF-AH后:(1)采用線拴法制備的大腦中動脈缺血再灌注模型小鼠腦梗塞的梗塞體積、神經(jīng)行為學的改變;(2)模型鼠腦MMPs、VEGF的蛋白表達;(3)模型鼠腦MMPs、VEGF的基因表達。初步探討rPAF-AH治療腦梗塞的有效性和可行性，評估該生物蛋白制劑的臨床開

21、發(fā)、應(yīng)用前景。
　　 材料與方法:
　　 一采用線栓法建立小鼠大腦中動脈缺血再灌注模型，尾靜脈注射rPAF-AH預(yù)處理后觀測模型小鼠神經(jīng)行為學和腦梗死灶大小的改變，采用Westernblot研究MMP-2、MMP-9和VEGF的表達及活性;rt-PCR研究MMP-2、MMP-9和VEGF基因表達的改變，同時與奧扎格雷鈉注射液、金納多注射液及假手術(shù)對照組比較。
　　 二于兔富含血小板血漿（PRP）中分別加入rPAF

22、-AH，使后者達到不同的最終濃度;另設(shè)一份不加rPAF-AH的PRP做為對照。各份PRP中加入10-8mol濃度的PAF并測血小板最大聚集率。觀察不同濃度rPAF-AH對兔富含血小板血漿PAF誘導(dǎo)的血小板聚集率的影響并和金納多比較。
　　 結(jié)果:
　　 1.rPAF-AH預(yù)處理組降低腦梗塞小鼠行為障礙的神經(jīng)行為學評分、腦梗死灶，與手術(shù)模型組比較，差異有顯著性意義(P＜0.01)。
　　 2.Westernblot

23、分析結(jié)果表明，與手術(shù)模型組比較，rPAF-AH預(yù)處理可降低腦缺血再灌注損傷所誘導(dǎo)的MMP-2蛋白、MMP-9蛋白的表達及其活性水平(P＜0.01);上調(diào)了VEGF蛋白的表達及其活性水平，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.001)。
　　 3.rt-PCR分析結(jié)果表明，與手術(shù)模型組比較，rPAF-AH預(yù)處理可降低腦缺血再灌注損傷所誘導(dǎo)的MMP-2mRNA、MMP-9mRNA的表達及其活性水平(P＜0.01);上調(diào)了VEGFmRNA的表達及

24、其活性水平，差異有顯著性意義(P＜0.001)。
　　 4.所有加入金納多注射液或rPAF-AH的PRP，其血小板最大聚集率都比對照PRP的低，且rPAF-AH對血小板最大聚集率的影響較金納多注射液更大，有顯著性意義(P＜0.01)。較高濃度的rPAF-AH，其血小板最大聚集率也較低。
　　 結(jié)論:
　　 1.小鼠腦缺血再灌注早期能誘導(dǎo)腦組織MMP-2，MMP-9的表達上調(diào)，從而導(dǎo)致BBB通透性增加和血管源性腦水