siRNA-DMAPA-CHEMS陽離子脂質(zhì)體復(fù)合物對SKOV3細(xì)胞Notch1基因沉默作用的研究.pdf

1、目的:本文利用基因干擾技術(shù)來抑制人卵巢癌SKOV3細(xì)胞Notch1基因的表達(dá)，在細(xì)胞水平上進(jìn)行Notch1基因敲除效率的評估。雖然基因干擾技術(shù)有著巨大的潛力，然而，siRNA易降解的特性限制其臨床應(yīng)用，并且siRNA遞送系統(tǒng)仍然存在著諸多缺陷，如轉(zhuǎn)染效率低、穩(wěn)定性差等問題。所以，設(shè)計(jì)高效、穩(wěn)定、安全的Notch1 siRNA載藥系統(tǒng)對增強(qiáng)抗卵巢癌作用具有非常重要的意義。本文合成N-(N，N'-二甲基)丙基丁二酸單膽固醇酯單酰胺(DMAP

2、A-CHEMS)陽離子膽固醇材料，合用大豆卵磷脂S100制備陽離子脂質(zhì)體，并對其制劑學(xué)特征，在核酸酶和血清中的穩(wěn)定性，細(xì)胞毒性，細(xì)胞攝取效率，Notch1 mRNA沉默和Notch1蛋白下調(diào)效率，增殖和凋亡方面進(jìn)行了評價(jià)，為構(gòu)建安全有效的siRNA載體系統(tǒng)提供了強(qiáng)有力的理論基礎(chǔ)。
　　方法:利用膽固醇、丁二酸酐、N，N-二甲基丙二胺(DMAPA)、DCC和NHS合成DMAPA-CHEMS，與大豆磷脂S100采用薄膜法制備陽離子脂質(zhì)

3、體。利用動(dòng)態(tài)激光散射儀(DLS)測DMAPA-CHEMS陽離子脂質(zhì)體粒徑和電位，透射電鏡觀察形態(tài)。1.5％瓊脂糖凝膠電泳分析脂質(zhì)體在0.1mg/mL RNase和25％ FBS環(huán)境中對siRNA保護(hù)作用。采用 CCK-8試劑盒考察了DMAPA-CHEMS陽離子脂質(zhì)體和N,C-siRNA-DMAPA-CHEMS陽離子脂質(zhì)體復(fù)合物細(xì)胞毒性，流式細(xì)胞儀和激光共聚焦顯微鏡考察了SKOV3對siRNA-DMAPA-CHEMS陽離子脂質(zhì)體復(fù)合物的攝

4、取，利用熒光定量PCR和Western Blot評價(jià)了Notch1-siRNA-DMAPA-CHEMS陽離子脂質(zhì)體復(fù)合物對Notch1基因的沉默效率。最后采用CCK-8試劑盒考查了Notch1-siRNA-DMAPA-CHEMS陽離子脂質(zhì)體復(fù)合物對SKOV3細(xì)胞增殖的影響，細(xì)胞凋亡試劑盒測定Notch1-siRNA-DMAPA-CHEMS陽離子脂質(zhì)體復(fù)合物對SKOV3細(xì)胞凋亡的影響。
　　結(jié)果:siRNA-DMAPA-CHEMS陽

5、離子脂質(zhì)體復(fù)合物的粒徑隨N/P比增加而減小。N/P=100時(shí)，粒徑(100.94±3.72) nm，電位(46.54±4.32) mV。透射電鏡顯示其為圓形或類圓形。RNase和血清穩(wěn)定性試驗(yàn)中，可以看到載體可以顯著提高siRNA穩(wěn)定性。流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示隨N/P比增加，細(xì)胞攝取增加，N/P=100時(shí)，攝取達(dá)到最大值。激光共聚焦顯微鏡結(jié)果顯示SKOV3細(xì)胞對siRNA-DMAPA-CHEMS陽離子脂質(zhì)體復(fù)合物攝取效率高。熒光定量PCR結(jié)

6、果表明N/P=100時(shí)，對SKOV3細(xì)胞Notch1mRNA表達(dá)抑制最大，其2-△△Ct為0.34±0.04，明顯低于空白組0.94±0.07。WesternBlot結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染Notch1-siRNA-DMAPA-CHEMS陽離子脂質(zhì)體復(fù)合物24小時(shí)后即可見SKOV3細(xì)胞Notch1蛋白表達(dá)明顯下調(diào)，轉(zhuǎn)染72 h后蛋白表達(dá)為(26.47±6.23)％，顯著低于對照組(100.00±11.02)％。CCK-8試劑盒檢測細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)可以看

7、到DMAPA-CHEMS陽離子脂質(zhì)體的細(xì)胞毒性較小，濃度＜100μ g/mL時(shí)，轉(zhuǎn)染后24 h、48 h或72 h，細(xì)胞存活率都高于80％。結(jié)果表明，DMAPA-CHEMS陽離子脂質(zhì)體作為基因運(yùn)送載體，本身并無明顯的細(xì)胞毒性，但是Notch1-siRNA-DMAPA-CHEMS陽離子脂質(zhì)體復(fù)合物對SKOV3細(xì)胞的增殖具有明顯的抑制作用，N/P比100時(shí)，轉(zhuǎn)染72 h后，細(xì)胞存活率下降到(60.45±2.24)％，與陰性對照(86.43±