小鼠胚胎干細胞Notch1基因沉默對Dvl-1和JNK-3表達的影響.pdf

1、胚胎干細胞(embryonic stem cells，ESCs)是一種高度未分化細胞，它具有發(fā)育的全能性，能分化出成體動物的所有組織和器官。ESCs研究的科學(xué)價值在于這種能夠自我更新具有多分化潛能的干細胞，在胚胎發(fā)育、移植治療、基因治療以及新藥開發(fā)等方面都有著廣闊的應(yīng)用前景，利用干細胞技術(shù)來治療疾病將是未來醫(yī)學(xué)的發(fā)展方向。 Notch1基因在許多組織細胞中表達，包括中樞神經(jīng)系統(tǒng)、胰腺、造血細胞等，它編碼一種跨膜受體蛋白，參與調(diào)

2、節(jié)各種各樣細胞分化及發(fā)育的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，并影響了多種生長發(fā)育過程。在ESCs中存在一種“旁側(cè)抑制”即位于ESCs表面的Notch1可與鄰近細胞表面的配體Delta結(jié)合，抑制其下游bHLH(basichelix-loop-helix)家族神經(jīng)分化基因如Mashl、NeuroD等的轉(zhuǎn)錄，從而抑制ESCs向神經(jīng)細胞轉(zhuǎn)化。因此，當(dāng)Notch1下調(diào)后，可以使ESCs從“旁側(cè)抑制”中釋放出來，進而促進ESCs向神經(jīng)細胞分化。 鑒于上述，本

3、實驗旨在構(gòu)建特異性Notch1的小干擾RNA(small interferingRNA，siRNA)真核表達載體抑制小鼠ESCs中Notch1基因的表達，并檢測dishevelled(Dvl)-1和c-jun terminal kinase(JNK)-3基因的mRNA表達變化，試圖從信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑分析Notch1表達受到抑制后對ESCs功能的影響。 方法： 1．構(gòu)建Notch1基因的siRNA真核表達載體：根據(jù)GenB

4、ank提供的Notch1基因的核苷酸序列，按照Ambion公司網(wǎng)站的siRNA設(shè)計工具設(shè)計兩對雙鏈siRNA，先克隆入T載體，經(jīng)篩選，鑒定，測序后，雙酶切靶基因，再亞克隆入siRNA載體pSINsi-U6中構(gòu)建重組體pSINsi-U6-1和pSINsi-U6-2，篩選，并用限制性內(nèi)切酶酶切進行鑒定。 2．通過脂質(zhì)體Lipofectamine 2000瞬時轉(zhuǎn)染小鼠ESCs 48小時，同時在瞬時轉(zhuǎn)染的基礎(chǔ)上，利用該載體帶有新霉素抗性篩選系統(tǒng)

5、，用G418篩選出陽性克隆，并用Real-Time PCR技術(shù)檢測Notchl，Dvl-1和JNK-3 mRNA的表達。 結(jié)果： 1．構(gòu)建了小鼠Notchl基因siRNA真核表達載體pSINsi-U6-1和pSINsi-U6-2，經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切和DNA測序證實與設(shè)計完全一致。 2．重組載體，空載體通過脂質(zhì)體Lipofectamine 2000瞬時轉(zhuǎn)染小鼠ESCs 48小時，Real-Time PCR檢測

6、Notchl mRNA的表達，結(jié)果顯示：未轉(zhuǎn)染組和空質(zhì)粒組Notchl mRNA的表達均無明顯變化，而重組載體pSINsi-U6-1和pSINsi-U6-2兩組Notchl mRNA的表達明顯下調(diào)。 3．pSINsi-U6-1的RNA干擾效果較pSINsi-U6-2強。 4．轉(zhuǎn)染后，用Real-Time PCR檢測了Dvl-1和JNK-3 mRNA的表達，結(jié)果顯示：Dvl．1和JNK-3 mRNA的表達均上調(diào)。