JNK1基因沉默對(duì)肺成纖維細(xì)胞增殖的影響.pdf

1、目的：
　　 闡明JNK/SAPK信號(hào)通路介導(dǎo)肺成纖維細(xì)胞在哮喘氣道重塑中的作用，研究C-Jun氨基末端激酶1(JNK1)基因沉默對(duì)總JNK蛋白水平表達(dá)、JNK蛋白磷酸化及人胚肺成纖維細(xì)胞(MRC-5)增殖的影響，深化哮喘發(fā)病機(jī)制理論，提供RNAi應(yīng)用于哮喘防治的新靶點(diǎn)。
　　 方法：
　　 設(shè)計(jì)針對(duì)JNK1基因的小RNA分子(siRNA)，以脂質(zhì)體(lipo2000)轉(zhuǎn)染法將雙鏈siRNA轉(zhuǎn)入MRC-5細(xì)胞后，

2、設(shè)定轉(zhuǎn)染siRNA濃度分別為0、20、30、50、100、200 nmol/L，用流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定轉(zhuǎn)染效率，得出針對(duì)MRC-5細(xì)胞的最佳轉(zhuǎn)染濃度。實(shí)驗(yàn)分空白對(duì)照組，脂質(zhì)體(lipo)組、JNK1-siRNA1組、JNK1-siRNA2和無(wú)關(guān)序列(NC-siRNA)組，以最佳濃度轉(zhuǎn)染細(xì)胞，用RT-PCR檢測(cè)JNK1 mRNA表達(dá)變化。取沉默效果較好的siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞并設(shè)置空白對(duì)照組、脂質(zhì)體組、無(wú)關(guān)序列組，用Western blot檢測(cè)總J

3、NK、磷酸化JNK(P-JNK)蛋白表達(dá)，用CCK-8法檢測(cè)siRNA對(duì)MRC-5細(xì)胞增殖的影響。
　　 結(jié)果：
　　 1.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)最佳轉(zhuǎn)染效率分別用濃度為0、20、30、50、100、200nmol/L NC-FAM-siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)帶有熒光的細(xì)胞占總細(xì)胞計(jì)數(shù)的百分比分別為0、66.1％、76.5％、89.5％、87.6％、84％。結(jié)果表明轉(zhuǎn)染MRC-5細(xì)胞的最佳siRNA濃度為50 nmol/L，濃

4、度小于最佳轉(zhuǎn)染濃度時(shí)，轉(zhuǎn)染效率隨濃度的增加而增加，大于最佳濃度后，增加siRNA濃度不會(huì)增加轉(zhuǎn)染效率。
　　 2.RT-PCR法檢測(cè)JNK1 mRNA相對(duì)表達(dá)量RT-PCR結(jié)果顯示，各組的JNK1 mRNA表達(dá)量分別為:空白對(duì)照組(0.674±0.131)、lipo組(0.658±0.112)、siRNA1組(0.337±0.059)、siRNA2組(0.410±0.069)、NC-siRNA組(0.645±0.125)。siR

5、NA1組和siRNA2組的JNK1mRNA表達(dá)量均明顯低于空白對(duì)照組、lipo組和無(wú)關(guān)序列組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。設(shè)計(jì)合成的siRNA1和siRNA2經(jīng)lipo2000介導(dǎo)轉(zhuǎn)染入MRC-5細(xì)胞后均可有效抑制目的基因JNK1的表達(dá)，抑制率分別可達(dá)到52.8％和49.9％，siRNA1的沉默率較siRNA2高，二者差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。
　　 3.Western blot法檢測(cè)細(xì)胞總JNK和P-JNK蛋白的

6、相對(duì)表達(dá)量JNK1-siRNA1組的總JNK蛋白表達(dá)水平低于其他三組，JNK1-siRNA1組(3.540±0.210)，空白對(duì)照組(5.433±0.311)、lipo組(5.515±0.353)、NC-s iRNA組(5.482±0.296)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。JNK1-siRNA1組的P-JNK蛋白表達(dá)水平亦低于其他三組，JNK1-siRNA1組(1.444±0.185)，空白對(duì)照組(2.230±0.221)、lip

7、o組(2.460±0.262)、NC-siRNA組(2.307±0.236)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 4.CCK-8方法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況JNK1-siRNA1組吸光度較其余三組減低，JNK1-siRNA1組(1.623±0.029)、空白對(duì)照組(2.085±0.063)、lipo組(2.078±0.051)、NC-siRNA組(2.057±0.052)。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染siRNA1的MRC-5細(xì)胞的增殖明顯被抑制

8、，最高抑制率為23.89％，組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　 結(jié)論：
　　 1.脂質(zhì)體可有效介導(dǎo)siRNA進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，引起目的基因部分沉默，但不能達(dá)到完全抑制目的基因的表達(dá)。
　　 2.對(duì)于MRC-5細(xì)胞，脂質(zhì)體介導(dǎo)的siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞的最佳濃度為50nmol/L。
　　 3.JNK1基因的沉默可引起總JNK蛋白表達(dá)的降低，同時(shí)降低JNK蛋白磷酸化水平，對(duì)MRC-5細(xì)胞的增殖起到抑制作用。<