小鼠孤雄胚胎干細(xì)胞的建立和應(yīng)用.pdf

1、孤雄胚胎由于缺少母源基因組而不能發(fā)育到期得到存活的動(dòng)物，但是孤雄胚胎能夠在體外發(fā)育至囊胚并且建系得到孤雄胚胎干細(xì)胞。由于孤雄胚胎干細(xì)胞的印記基因的表觀遺傳狀態(tài)在體外培養(yǎng)過(guò)程中很難被改變，所以導(dǎo)致其產(chǎn)生嵌合體的能力較低。
　　 本研究借助“一步法”核移植技術(shù)高效地進(jìn)行孤雄胚胎的重構(gòu)，并利用一種化學(xué)小分子-CBHA去處理孤雄胚胎，通過(guò)整個(gè)基因組的表觀遺傳修飾來(lái)改變孤雄胚胎的發(fā)育潛能及孤雄胚胎干細(xì)胞的多能性。與沒(méi)有經(jīng)過(guò)CBHA處理的對(duì)

2、照組相比，實(shí)驗(yàn)組的孤雄胚胎在體外有較高的囊胚率，并且相應(yīng)的孤雄胚胎干細(xì)胞也能夠通過(guò)囊胚注射的方法獲得健康的嵌合體動(dòng)物。通過(guò)亞硫酸氫鹽測(cè)序發(fā)現(xiàn)，CBHA處理過(guò)后得到的孤雄胚胎干細(xì)胞的H19的差異甲基化區(qū)域(DMR)的甲基化狀態(tài)得到了改變。同時(shí)，real-time PCR實(shí)驗(yàn)分析發(fā)現(xiàn)這些孤雄胚胎干細(xì)胞中的印記基因H19、Dio3和U2af1-rs1的基因表達(dá)量已趨近于受精卵來(lái)源的胚胎干細(xì)胞的表達(dá)量。CBHA所帶來(lái)的這些分子生物學(xué)變化有可能與

3、孤雄胚胎干細(xì)胞多能性改善有關(guān)，這也為我們提供了一種改變孤雄胚胎干細(xì)胞多能性的新方法，同時(shí)也對(duì)于我們更好的理解表觀遺傳調(diào)控提供了新的研究思路。
　　 孤雄單倍體胚胎可以通過(guò)“一步法”核移植技術(shù)將精子注射入去核卵母細(xì)胞中得到，這些胚胎可以建立得到孤雄單倍體胚胎干細(xì)胞系。孤雄單倍體胚胎干細(xì)胞具有典型的胚胎干細(xì)胞的集落，表達(dá)多能性標(biāo)記物，能夠形成畸胎瘤和嵌合體，同時(shí)還具有生殖系嵌合的能力，是一類新型的具有多能性的胚胎干細(xì)胞。通過(guò)對(duì)孤雄單

4、倍體胚胎干細(xì)胞構(gòu)建的嵌合體胚胎進(jìn)行DNA含量分析發(fā)現(xiàn)，在嵌合體胚胎發(fā)育第6.5(E6.5)天時(shí)仍然可以檢測(cè)到單倍體的存在，所以，本研究通過(guò)將孤雄單倍體胚胎干細(xì)胞進(jìn)行體外分化，獲得了上胚層樣的單倍體胚胎干細(xì)胞(Haploid EpiSC-like cells)系。隨后，將這些上胚層樣的單倍體胚胎干細(xì)胞進(jìn)行神經(jīng)分化，能夠迅速地得到神經(jīng)干細(xì)胞，并且這些神經(jīng)干細(xì)胞中也有一定比例的單倍體細(xì)胞存在。
　　 本研究在卵母細(xì)胞胞漿內(nèi)注射孤雄單倍