陽(yáng)離子脂質(zhì)體通過(guò)抑制晚期自噬流導(dǎo)致細(xì)胞死亡.pdf

1、陽(yáng)離子脂質(zhì)體作為非病毒載體被大量應(yīng)用于基因治療，目前為止已經(jīng)有兩個(gè)相關(guān)臨床試驗(yàn)已經(jīng)開(kāi)展，分別是治療肺泡囊性纖維化和難治性白血病的研究，很不幸的是這些臨床試驗(yàn)因?yàn)殡y以預(yù)料的相關(guān)致死性副作用而未能如期進(jìn)入二期臨床試驗(yàn)或者在病人招募階段遇到困難。于是探索其毒性機(jī)制變得尤為關(guān)鍵。目前檢索到的關(guān)于陽(yáng)離子脂質(zhì)體細(xì)胞毒性的文章有一篇15年1月份發(fā)表在cellreasearch的研究報(bào)道了陽(yáng)離子脂質(zhì)體通過(guò)損壞Na+/K+-ATP酶泵的作用而導(dǎo)致細(xì)胞壞死

2、，但是作者依然認(rèn)為需要更多的研究去闡明陽(yáng)離子脂質(zhì)體的生物學(xué)效應(yīng)，繼續(xù)檢索文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)陽(yáng)離子脂質(zhì)體對(duì)自噬流的影響發(fā)現(xiàn)有2個(gè)研究報(bào)道:Roberts R發(fā)現(xiàn)陽(yáng)離子脂質(zhì)體引發(fā)自噬，Man N等發(fā)現(xiàn)陽(yáng)離子脂質(zhì)體激活自噬是mTOR非依賴的。需要注意的是自噬流是一個(gè)動(dòng)態(tài)過(guò)程，也就是說(shuō)自噬流可能在一段時(shí)間區(qū)間內(nèi)激活阻斷交替出現(xiàn)，預(yù)示著應(yīng)該多個(gè)時(shí)間點(diǎn)來(lái)評(píng)估自噬，所以，假設(shè)陽(yáng)離子脂質(zhì)體可能是動(dòng)態(tài)調(diào)控自噬的:也就是陽(yáng)離子脂質(zhì)體早期激活自噬流然后晚期將其阻斷，陽(yáng)

3、離子脂質(zhì)體產(chǎn)生的細(xì)胞毒性是由于其抑制了自噬這一腫瘤細(xì)胞的自我保護(hù)機(jī)制。
　　為了闡明陽(yáng)離子脂質(zhì)體細(xì)胞毒性的潛在機(jī)制，細(xì)致研究了陽(yáng)離子脂質(zhì)體細(xì)胞毒性，陽(yáng)離子脂質(zhì)體對(duì)人肝臟表皮細(xì)胞系（因?yàn)榇蟛糠旨{米顆粒主要累計(jì)在肝臟）自噬流的影響。
　　本文的研究?jī)?nèi)容分為四個(gè)部分:(1)制備表征優(yōu)異的陽(yáng)離子脂質(zhì)體，并可以導(dǎo)致細(xì)胞壞死。(2)揭示陽(yáng)離子調(diào)控自噬流的過(guò)程是動(dòng)態(tài)的。(3)探索陽(yáng)離子脂質(zhì)體阻斷晚期自噬流的機(jī)制(4)說(shuō)明細(xì)胞毒效應(yīng)至少和阻

4、斷自噬導(dǎo)致的損傷有關(guān)。
　　第一部分，本實(shí)驗(yàn)室納米脂質(zhì)體制備工藝成熟，采用薄膜分散法制備產(chǎn)生的納米脂質(zhì)體通過(guò)馬爾文動(dòng)態(tài)掃描顯示脂質(zhì)體粒徑大小為166.13±6.2 nm且分布結(jié)果優(yōu)異，PDI系數(shù)0.11±0.05，陽(yáng)性電荷為36.57±3.27 mv。通過(guò)TEM可以看到陽(yáng)離子脂質(zhì)體為球形，雙層膜結(jié)構(gòu)，大小大約100 nm左右。接著將陽(yáng)離子脂質(zhì)體作用于細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)細(xì)胞活性下降，且這種下降不是抑制細(xì)胞增殖而是導(dǎo)致細(xì)胞死亡引起的。

5、　　第二部分，揭示陽(yáng)離子調(diào)控自噬流的過(guò)程是動(dòng)態(tài)的。前人的研究顯示陽(yáng)離子脂質(zhì)體可以激活自噬，首先通過(guò)WB(western blot)試驗(yàn)重復(fù)出來(lái)了這一結(jié)果，但是隨著時(shí)間的進(jìn)行，發(fā)現(xiàn)陽(yáng)離子脂質(zhì)體最終是阻斷自噬的，這種調(diào)控是mTOR(mechanistic target of rapamycin)非依賴的。為了驗(yàn)證這一發(fā)現(xiàn)，使用LC3串聯(lián)RFP和GFP的雙熒光蛋白(RFP-GFP-LC3 Tandem mRFP/mCherry-GFP flu

6、orescence)來(lái)檢測(cè)自噬流，結(jié)果和WB一直，為了再次驗(yàn)證陽(yáng)離子最終阻斷自噬，通過(guò)加入自噬阻斷劑CQ(chloroquine)后通過(guò)WB和Cyto-ID(CYTO-ID Autophagy Detection Kit)來(lái)驗(yàn)證，結(jié)果證實(shí)了陽(yáng)離子脂質(zhì)體晚期的確是阻斷自噬流。
　　第三部分，探索陽(yáng)離子脂質(zhì)體阻斷晚期自噬流的機(jī)制。通過(guò)LC3-GFP和Lysotraker-red染色后共聚焦拍攝觀察到自噬流的融合受到了影響，然后通過(guò)電鏡

7、發(fā)現(xiàn)溶酶體變肥大，腫脹，同時(shí)線粒體嵴膜結(jié)構(gòu)消失，和大量自噬小體的產(chǎn)生，為了進(jìn)一步說(shuō)明溶酶體發(fā)生了哪些變化，我們同過(guò)Acridine orange(AO)染色和LysoSensor Green DND-189染料發(fā)現(xiàn)溶酶體內(nèi)酸性環(huán)境被堿性化，接著通過(guò)多功能酶標(biāo)儀發(fā)現(xiàn)溶酶體的酸性磷酸酶活性下降，說(shuō)明其降解能力下降。
　　第四部分，說(shuō)明細(xì)胞毒效應(yīng)至少和阻斷自噬導(dǎo)致的損傷有關(guān)。已經(jīng)有研究報(bào)道了陽(yáng)離子脂質(zhì)體可以導(dǎo)致溶酶體膜滲透性增加，導(dǎo)致蛋

8、白激酶cathepsinB釋放出來(lái)，然后損傷線粒體和導(dǎo)致活性氧上升，引起細(xì)胞死亡。為了驗(yàn)證這一機(jī)制，接著通過(guò)MitoTracker green(MTR green)和CM-H2DCFDA green(ROS green)標(biāo)記發(fā)現(xiàn)了陽(yáng)離子脂質(zhì)體可以導(dǎo)致細(xì)胞的線粒體發(fā)生功能障礙和活性氧上調(diào)，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡，這種調(diào)控機(jī)制可以被SiRNA-ATG7基因干擾和自噬阻斷劑再現(xiàn)，并且可以被活性氧清除劑N-乙酰半胱氨酸NAC部分逆轉(zhuǎn)。說(shuō)明陽(yáng)離子脂質(zhì)體