腫瘤抑制基因XAF1誘導胃癌細胞自噬性死亡的實驗研究.pdf

1、背景與目的：
　　 自噬性死亡被稱為Ⅱ型程序性細胞死亡，新近研究發(fā)現(xiàn)自噬在腫瘤抑制中具有重要作用。我們前期的研究發(fā)現(xiàn)X染色體連鎖的凋亡抑制蛋白相關因子1(XIAP相關因子1，XAF1)可通過誘導凋亡而促進胃癌細胞的死亡。我們進一步研究發(fā)現(xiàn)，應用凋亡抑制劑可抑制XAF1誘導的凋亡，但是并不能完全抑制細胞死亡，表明XAF1基因除誘導腫瘤細胞凋亡外，還存在著其他促進細胞死亡的機制。本實驗研究腫瘤抑制基因XAF1誘導胃癌細胞自噬性死亡的

2、作用及相關的分子機制。
　　 方法：
　　 1.制備重組腺病毒Adeno-XAF1和對照病毒Adeno-Null，感染人胃癌細胞MKN45和AGS，應用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)和蛋白質(zhì)免疫印跡法(Westernblot)檢測XAF1基因在胃癌細胞中的表達。
　　 2.應用以下多種方法檢測XAF1誘導胃癌細胞的自噬作用：(1)Western blot檢測LC3蛋白的表達，其中LC3Ⅱ的表達與自噬體膜的形成

3、密切相關；(2)電鏡觀察自噬體的超微結(jié)構(gòu)；(3)熒光顯微鏡觀察GFP-LC3融合蛋白的定位；(4)流式細胞術(shù)檢測AVOs。Western blot檢測Beclin1、phospho-Akt和phospho-p70S6k蛋白的表達探討XAF1誘導自噬的機制。
　　 3.應用Beclin1 siRNA、自噬抑制劑3-MA抑制自噬作用及凋亡抑制劑Z-VAD-FMK抑制凋亡作用，流式細胞術(shù)檢測凋亡或自噬作用，統(tǒng)計學分析XAF1誘導的自噬

4、與凋亡的相互關系。
　　 4.建立裸鼠胃癌移植瘤模型，Western blot及免疫組化檢測XAF1、LC3和Beclin1蛋白的表達，研究XAF1基因在體內(nèi)誘導胃癌細胞自噬性死亡的作用。
　　 結(jié)果：
　　 1.成功制備重組腺病毒Adeno-XAF1和對照病毒Adeno-Null，胃癌細胞MKN45和AGS感染Adcno-XAF1病毒后，XA目的mRNA水平和蛋白表達與PBS組及陰性病毒對照組相比，均明顯升高。

5、
　　 2.Adeno-XAF1可誘導胃癌細胞的自噬性死亡，其主要機制是上調(diào)Beclin1的表達及抑制Akt/mTOR/p70S6K信號通路。
　　 3.下調(diào)Beclin1或應用3-MA抑制自噬可促進XAF1基因誘導的胃癌細胞凋亡，抑制凋亡促進XAF1基因誘導的胃癌細胞的自噬性死亡。
　　 4.XAF1基因可誘導移植瘤細胞的自噬性死亡，抑制裸鼠移植瘤的生長。
　　 結(jié)論：
　　 XAF1基因可誘導