磁性靶向治療動(dòng)脈粥樣硬化不穩(wěn)定斑塊的DNA-陽離子脂質(zhì)體復(fù)合物的研究.pdf

1、動(dòng)脈粥樣硬化(Atherosclerosis,AS)性疾病是嚴(yán)重危害人類健康的一大類疾病,致死、致殘率高。目前對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化仍無好的治療方法,主要是通過識(shí)別動(dòng)脈粥樣硬化不穩(wěn)定斑塊(unstable plaque)并及早臨床干預(yù),增強(qiáng)斑塊的穩(wěn)定性。而基因治療(Gene therapy)是穩(wěn)定動(dòng)脈粥樣硬化不穩(wěn)定斑塊很有前途的一種治療方法。近年來的研究表明,載脂蛋白(Apo-AI)和B族I型清道夫受體(SR-BI)的表達(dá)對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化均具有保

2、護(hù)作用,其過度表達(dá)均能明顯減少動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生。基于此,本研究將APO-AI和SR-BI基因作為治療動(dòng)脈粥樣硬化不穩(wěn)定斑塊的治療基因。 目前基因治療載體可分兩大類：病毒載體和非病毒載體。陽離子脂質(zhì)體(cationic liposomes,CL)是目前用于基因治療的研究最廣泛的非病毒類載體之一,具有毒性低、轉(zhuǎn)移的核苷酸大小范圍廣(從寡核苷酸到人工染色體均可)、制備方法較簡單等優(yōu)點(diǎn)。但是該載體仍存在轉(zhuǎn)染效率較低、靶向性差等問題。因

3、此,提高CL的靶向性是當(dāng)前基因載體研究的重要發(fā)展方向之一。為提高CL的靶向性,本研究將磁靶向給藥系統(tǒng)的原理引入CL介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)染中,即制備磁性陽離子脂質(zhì)體(Magnetic cationic liposomes,MCL)。通過在脂質(zhì)體中摻入一定數(shù)量、-定粒徑的磁性納米粒子,利用體外磁場(chǎng)的效應(yīng)可以引導(dǎo)MCL/DNA復(fù)合物在體內(nèi)定向移動(dòng)和定位集中,從而達(dá)到在靶組織目的基因高效靶向表達(dá)的效果。本研究制備得到磁性陽離子脂質(zhì)體/DNA復(fù)合物,通過

4、體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)及大鼠體內(nèi)靶向性實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了其用于提高陽離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的靶向性從而提高轉(zhuǎn)染效率的可行性,還通過大鼠體內(nèi)的初步藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證其用于磁性靶向治療動(dòng)脈粥樣硬化不穩(wěn)定斑塊的可行性。 本研究將大鼠Apo-AI、SR-BI基因以及蟲熒光素酶(luciferase)報(bào)告基因克隆到真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1(+)中,分別構(gòu)建重組成pcDNA3.1(+)/APO-AI、pcDNA3.1(+)/SR-BI和pcDNA-CMV lucif

5、erase表達(dá)質(zhì)粒。由此構(gòu)建成的表達(dá)載體可以在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中高效表達(dá)。還通過酶解和測(cè)序鑒定了三種質(zhì)粒的準(zhǔn)確性。 本研究建立了鄰菲噦啉法測(cè)定鐵含量,以吸收度A為縱坐標(biāo),以濃度C(μg/mL)為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸,得到直線方程為:A=0.0198C-0.0072,r=0.9999。結(jié)果表明,濃度在5-30 μg/mL,的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。低、中、高濃度下的回收率、精密度均符合方法學(xué)要求。本研究以二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)以及3

6、β-[N-(N',N'-二甲氨基乙基)]氨甲酰基-膽固醇(DC-Chol)為脂質(zhì)體的脂質(zhì)成分,并采用逆相蒸發(fā)法制備磁性陽離子脂質(zhì)體(MCL)。通過單因素考察確定MCL的制備條件為：有機(jī)溶劑選擇體積比1:9的氯仿/乙醚混合溶劑；油水相體積比4:1;pH為7.4的磷酸鹽緩沖液(PBS)作分散介質(zhì)；α-生育酚用量為磷脂質(zhì)量的1％；采用輻射滅菌法對(duì)脂質(zhì)體除菌。本研究采用紫外分光光度法建立了質(zhì)粒DNA含量測(cè)定方法,以紫外吸收強(qiáng)度A為縱坐標(biāo),以濃度

7、C(μg/mL)為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸,得到直線方程為:A=0.0207C+0.0009,r=0.9999。結(jié)果表明,濃度在1.25-20μg/mL的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。采用低溫高速離心法測(cè)定DNA包封率,回收率實(shí)驗(yàn)符合要求。 對(duì)復(fù)合物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳考察形成穩(wěn)定復(fù)合物所需的最低DC-Chol/DNA質(zhì)量比值為2?？疾炝薉C-Chol/DNA質(zhì)量比對(duì)MCL/DNA復(fù)合物的粒徑、zeta電位以及DNA包封率的影響,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明DC

8、-Chol/DNA質(zhì)量比值大于等于9時(shí)制得的復(fù)合物結(jié)構(gòu)較穩(wěn)定,DNA包入囊泡中可有效被保護(hù)從而保證較高的轉(zhuǎn)染效率,因此本研究優(yōu)選了DC-Chol/DNA質(zhì)量比為9的復(fù)合物,用于后面的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)部分。并對(duì)優(yōu)化后的MCL/DNA復(fù)合物進(jìn)行了相關(guān)性質(zhì)的考察：用透射電子顯微鏡觀察復(fù)合物的形態(tài)并對(duì)其進(jìn)行能譜分析,結(jié)果表明制得的復(fù)合物內(nèi)含有磁性物質(zhì)及DNA;用納米粒度及電位分析儀測(cè)得復(fù)合物的粒徑為343.4nm,多分散系數(shù)0.231,符合預(yù)期要求,復(fù)

9、合物的zeta電位為+37.5mV,體系穩(wěn)定性較好；復(fù)合物中DNA的包封率為79.5％；體外磁場(chǎng)響應(yīng)性能考察則表明復(fù)合物保留了磁性脂質(zhì)體的良好的磁場(chǎng)相應(yīng)性能。 本研究采用MTT法測(cè)定不同的鐵含量的MCL以及CL對(duì)人正常肝細(xì)胞(THLE-3)的毒性,結(jié)果表明鐵含量為80μg/mL的MCL,對(duì)細(xì)胞的毒性與CL相似,均不大,細(xì)胞存活率均在80％以上。結(jié)果還表明當(dāng)DC-Chol/DNA的質(zhì)量比≥15時(shí)各組制劑均表現(xiàn)出一定的細(xì)胞毒性,且當(dāng)

10、鐵含量達(dá)到176.5μg/mL時(shí),細(xì)胞毒性作用較80μg/mL,組有明顯增大(P<0.05)。由于細(xì)胞的轉(zhuǎn)染與細(xì)胞的狀態(tài)有較大關(guān)系,因此本實(shí)驗(yàn)選擇鐵含量為131.6μg/mL和80μg/mL的MCL進(jìn)行進(jìn)-步的細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn),且各組制劑的DC-Chol/DNA的質(zhì)量比均選擇在≤10。 本研究用重新構(gòu)建的pcDNA-CMV luciferase質(zhì)粒作報(bào)告基因,優(yōu)化了MCL與CL在THLE-3中的轉(zhuǎn)染條件并比較了在最優(yōu)轉(zhuǎn)染條件下MCL

11、(加外加磁場(chǎng)與自然條件下)與CL的轉(zhuǎn)染效率。MCL的最優(yōu)轉(zhuǎn)染條件為DC-Chol/DNA質(zhì)量比為5,MCL/DNA復(fù)合物與細(xì)胞的作用時(shí)間為8h,外加磁場(chǎng)的作用時(shí)間為30min。CL的最優(yōu)轉(zhuǎn)染條件為DC-Chol/DNA質(zhì)量比為2.5,CL/DNA復(fù)合物與細(xì)胞的作用時(shí)間為8h。最優(yōu)轉(zhuǎn)染條件下,自然條件下的MCL的轉(zhuǎn)染效率與CL無差別,但是在外加磁場(chǎng)的作用下,MCL在THLE-3細(xì)胞中轉(zhuǎn)染效率較CL提高了2.6倍(P<0.01)。

12、本研究對(duì)MCL/DNA復(fù)合物在大鼠體內(nèi)的靶向性進(jìn)行了初步研究。大鼠尾靜脈注射MCL/DNA復(fù)合物,在其肝部固定釹鐵硼永磁鐵進(jìn)行磁場(chǎng)導(dǎo)向,24h后測(cè)定報(bào)告基因在心、肝、脾、肺、腎中的表達(dá)情況。其中,在肝臟中的表達(dá)結(jié)果表明,MCL/DNA復(fù)合物有外加磁場(chǎng)誘導(dǎo)下(+)的熒光素酶的表達(dá)分別為自然條件下(-)及CUDNA復(fù)合物的1.5倍(P<0.01)和2.7倍(P<0.01)。 本研究以APO-AI和SR-BI作為治療基因,MCL為基因

13、載體并加以磁場(chǎng)導(dǎo)向,對(duì)大鼠動(dòng)脈粥樣硬化模型進(jìn)行基因治療的初步研究。血脂測(cè)定結(jié)果表明,與對(duì)照組比較,可見6周后各基因治療組的血清總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL)明顯下降(P<0.01),高密度脂蛋白(HDL)明顯升高(P<0.01)。病理學(xué)大體標(biāo)本的觀察結(jié)果顯示各基因治療組動(dòng)脈粥樣硬化斑塊減小,部分血管管壁變?nèi)彳?彈性恢復(fù),管腔內(nèi)膜變光滑,血管管壁增厚不明顯。經(jīng)油紅O染色的病理學(xué)觀察顯示：血管內(nèi)膜表面不規(guī)則的紅色

14、隆起減少,基因治療組-脂質(zhì)條紋面積和纖維斑塊面積的百分比分別為9.21％和1.16％,組二分別為9.20％和1.18％。鏡下觀察結(jié)果顯示內(nèi)皮細(xì)胞增生減弱,纖維膜下可見少量泡沫細(xì)胞聚集。對(duì)照組血管管壁仍明顯僵硬增厚,血管內(nèi)膜表面多發(fā)不規(guī)則的紅色隆起,脂質(zhì)條紋面積和纖維斑塊面積的百分比分別為32.25％和1.66％。鏡下顯示內(nèi)皮細(xì)胞增生明顯,纖維膜下可見大量泡沫細(xì)胞聚集,斑塊突向管腔,呈典型的脆性斑塊表現(xiàn)。以上血脂測(cè)定結(jié)果以及病理結(jié)果均可說