生物可降解siRNA-PLGA-CSO共軛物膠束對SKOV3細胞STAT3基因沉默作用的研究.pdf

1、目的：利用siRNA干擾技術(shù)來抑制人卵巢癌SKOV3細胞中信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄活化因子3（STAT3）的表達，在細胞水平上進行STAT3 siRNA基因敲除效率的評估。然而，siRNA給藥系統(tǒng)仍然存在著許多不足，如轉(zhuǎn)染效率低、易被核酸酶降解等問題。所以，設(shè)計高效、穩(wěn)定、安全的靶向SKOV3細胞中STAT3基因的siRNA載藥系統(tǒng)對增強抗卵巢癌作用具有非常重要的意義。本文制備了基于二硫鍵的siRNA-PLGA/CSO共軛物膠束，并對其制劑學(xué)特征

2、，在核酸酶中的穩(wěn)定性，細胞攝取效率，STAT3基因沉默效率，細胞增殖和凋亡等方面進行了評價，為構(gòu)建安全有效的抗腫瘤siRNA納米載體系統(tǒng)提供了強有力的理論基礎(chǔ)。
　　方法：首先，本文在調(diào)研了大量相關(guān)文獻基礎(chǔ)上，采用NHS/DCC和PDPH通過兩步法合成并表征了siRNA-PLGA共軛物，在水性環(huán)境中自組裝形成siRNA-PLGA共軛物膠束，并與CSO按不同N/P比孵育后制備得到siRNA-PLGA/CSO膠束。其次，采用芘熒光探針

3、法測定siRNA-PLGA共軛物膠束的CMC值；利用動態(tài)激光散射儀（DLS）測定siRNA-PLGA/CSO聚合物膠束的粒徑、粒徑分布和Zeta電位；透射電鏡（TEM）觀察膠束的形態(tài)，并用瓊脂糖凝膠電泳分析膠束在核酸酶存在條件下的穩(wěn)定性。最后，通過流式細胞儀考察了SKOV3對siRNA-PLGA/CSO膠束的攝取率，利用熒光定量PCR和Western Blot評價了膠束對STAT3基因的沉默效率，并采用CCK-8和細胞凋亡試劑盒測定了膠

4、束對SKOV3細胞增殖和凋亡兩方面的影響。
　　結(jié)果：核磁共振圖譜確證了 PLGA-PDPH的成功合成，其嫁接率為（94.26±2.11）％，siRNA-PLGA的接枝率為（87.41±2.87）%，其CMC值約為3mg/L。siRNA-PLGA膠束的粒徑為（204.97±9.72）nm，Zeta電位為（-43.48±1.33） mV，重現(xiàn)性良好。不同N/P比的siRNA-PLGA/CSO膠束的粒徑在150~190 nm之間，Ze

5、ta電位隨著N/P比的增加而上升，當(dāng)N/P比為80時，電位為（39.42±1.58）mV。透射電鏡觀察得到的siRNA-PLGA和siRNA-PLGA/CSO膠束均為近圓形。流式細胞儀測得siRNA-PLGA/CSO膠束的細胞攝取率隨N/P比的增加而增加，N/P比為80的 siRNA-PLGA/CSO膠束的細胞攝取率為（91.92±6.16）%，與lipofectamin2000組無顯著性差異。熒光定量PCR結(jié)果證明siRNA-PLGA

6、/CSO膠束（N/P=80）對STAT3 mRNA表達具有明顯的抑制作用，其2-ΔΔCt值為0.22±0.14，顯著低于對照組0.87±0.13。Western Blot結(jié)果表明，N/P比為80的siRNA-PLGA/CSO膠束組使得 STAT3蛋白的表達量明顯降低，蛋白表達為（33.32±8.99）%，顯著低于對照組（90.33±12.87）%。CCK-8試劑盒檢測結(jié)果證明，陰性siRNA-PLGA膠束作為siRNA的運送載體，本身并

7、無明顯的細胞毒性，但是STAT3 siRNA-PLGA/CSO膠束對細胞的增殖具有明顯的抑制作用，當(dāng)N/P=80，72h后，細胞存活率僅為（45.62±8.65）%，明顯低于對照組（93.54±6.37）%。流式細胞儀檢測細胞凋亡結(jié)果表明，siRNA-PLGA/CSO膠束組對細胞的凋亡具有明顯促進作用，其細胞凋亡率為（18.64±3.37）%，明顯高于對照組（9.30±0.95）%。
　　結(jié)論：本研究制備的siRNA-PLGA/C