RNA干擾沉默STAT3基因?qū)Ω伟〩epG2及SMMC-7721細(xì)胞株的影響研究.pdf

1、肝細(xì)胞癌是常見的危害人類健康的惡性腫瘤之一，其發(fā)生、發(fā)展過程受諸多因素的影響。傳統(tǒng)的放療、化療及手術(shù)治療手段仍不能獲得理想治療效果。為此，基因治療成為目前肝癌的研究熱點(diǎn)。信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子(signal transducers and activators of transcription，STATs)是研究干擾素誘導(dǎo)基因轉(zhuǎn)錄時首次鑒定的一個胞漿蛋白家族。研究發(fā)現(xiàn)，STATs具有強(qiáng)烈的抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用，參與了人類惡性

2、腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和演變，其中以STAT3尤為活躍。STAT3信號傳導(dǎo)通路與細(xì)胞的增殖、分化及凋亡密切相關(guān)，該通路持續(xù)激活可導(dǎo)致細(xì)胞異常增殖和惡性轉(zhuǎn)化，目前已被定義為癌基因。RNA干擾(RNA interference，RNAi)是近年發(fā)現(xiàn)的一種重要的轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默方式。它能觸發(fā)某種轉(zhuǎn)錄后監(jiān)控程序，導(dǎo)致特定mRNA單鏈的降解。本實(shí)驗(yàn)利用RNAi技術(shù)，設(shè)計(jì)短發(fā)夾樣RNA(small hairpin RNA，shRNA)并構(gòu)建靶向STA

3、T3的shRNA-DNA質(zhì)粒，篩選穩(wěn)定表達(dá)小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)的肝癌HepG2及SMMC-7721細(xì)胞株，體外研究siRNA穩(wěn)定和特異性誘導(dǎo)肝癌STAT3基因轉(zhuǎn)錄后沉默并逆轉(zhuǎn)其惡性表型的能力，探索肝癌治療新方法。 目的：探討應(yīng)用RNAi技術(shù)沉默信號轉(zhuǎn)導(dǎo)子與轉(zhuǎn)錄活化子(STAT3)基因?qū)Ω伟〩epG2及SMMC-7721細(xì)胞的影響。 方法：針對STAT3 mRNA序列設(shè)計(jì)合

4、成3對編碼小干擾RNA(siRNA)的DNA模板，通過定向克隆至質(zhì)粒pGenesil-1，構(gòu)建靶向抑制STAT3基因表達(dá)的短發(fā)夾雙鏈RNA(shRNA)真核表達(dá)載體pGenesil-1-shRNA-STAT3，將其轉(zhuǎn)化DH5α大腸桿菌，提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定和測序分析；將鑒定正確的重組表達(dá)質(zhì)粒用脂質(zhì)體LipofactaminTM2000轉(zhuǎn)染人肝癌細(xì)胞HepG2及SMMC-7721細(xì)胞。通過半定量RT-PCR、Western blot檢測S

5、TAT3基因mRNA和蛋白水平的表達(dá)情況，采用MTT實(shí)驗(yàn)、流式細(xì)胞術(shù)檢測轉(zhuǎn)染后細(xì)胞增殖及細(xì)胞周期的變化。 結(jié)果：成功構(gòu)建了pGeneSil 1.0-shRNA-STAT3重組質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)染HepG2及SMMC-7721肝癌細(xì)胞；半定量RT-PCR、Western blot結(jié)果顯示，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的STAT3基因的mRNA及蛋白表達(dá)水平顯著低于對照組；MTT實(shí)驗(yàn)、流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的增殖明顯抑制，S期細(xì)胞