多酚類化合物L(fēng)M49對血管內(nèi)皮細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用及機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　課題組前期合成一種全新結(jié)構(gòu)的多酚類化合物L(fēng)M49，該化合物不僅具有很強(qiáng)的體外抗氧化活性，而且有顯著的抗大鼠動脈粥樣硬化、抗心肌缺血再灌注損傷等多種藥理活性，但其具體機(jī)制尚不清楚。因此本論文試圖通過LM49對H2O2誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞氧化損傷及對糖尿病大鼠的保護(hù)作用及其可能的分子機(jī)制進(jìn)行探討，為此類化合物的進(jìn)一步研究及其應(yīng)用提供依據(jù)。
　　方法：
　?。?）采用MTT法檢測H2O2對EA.hy926細(xì)胞活力影響

2、及LM49對H2O2誘導(dǎo)的EA.hy926細(xì)胞活力下降的抑制作用；
　?。?）采用人全基因組表達(dá)譜芯片技術(shù)研究LM49對H2O2誘導(dǎo)EA.hy926細(xì)胞損傷保護(hù)作用的調(diào)控機(jī)制；
　?。?）采用Western blot檢測LM49對H2O2誘導(dǎo)EA.hy926細(xì)胞NOD1、NF-κB、ICAM-1、E-selectin及MAPK的表達(dá)影響；
　?。?）采用細(xì)胞免疫熒光法檢測LM49對H2O2誘導(dǎo)EA.hy926細(xì)胞NF-

3、κB核轉(zhuǎn)入水平的影響；
　?。?）采用Annexin V-FITC/PI雙染法檢測LM49對H2O2誘導(dǎo)EA.hy926細(xì)胞凋亡的影響；
　?。?）采用RT-PCR檢測LM49對H2O2誘導(dǎo)EA.hy926細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bax mRNA、Bcl-2 mRNA的表達(dá)影響；
　?。?）采用Western blot檢測LM49對H2O2誘導(dǎo)EA.hy926細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2、cleaved caspase-

4、3的表達(dá)影響；
　?。?）采用高糖高脂飼料結(jié)合STZ聯(lián)合誘導(dǎo)建立糖尿病大鼠模型進(jìn)行LM49體內(nèi)抗炎、抗氧化作用研究，通過血糖測定、血清中NOD1、NF-κB、ICAM-1、IL-6、MDA含量及氧化還原酶SOD、GSH-Px活性檢測，初步闡明LM49具有體內(nèi)抗炎及抗氧化活性。
　　結(jié)果：
　　（1）LM49在濃度小于20μmol/L時對EA.hy926細(xì)胞活力沒有影響；
　　（2）LM49在5、10和20μmol

5、/L濃度時具有明顯抑制H2O2誘導(dǎo)的EA.hy926細(xì)胞活力下降作用（p<0.05），并呈明顯劑量依賴關(guān)系；
　?。?）基因芯片分析結(jié)果表明H2O2組與正常對照組比較，其差異基因數(shù)量為182條，其中上調(diào)表達(dá)基因數(shù)量為141條，下調(diào)表達(dá)基因數(shù)量為41條；LM49保護(hù)作用組與H2O2組比較，其差異基因數(shù)量為1083條，其中上調(diào)表達(dá)基因數(shù)量為419條，下調(diào)表達(dá)基因數(shù)量為664條，且多條差異基因與炎癥和凋亡相關(guān)，諸如趨化因子（chemok

6、in）相關(guān)基因（CCL2、CXCR4、CXCL3、CXCL6及CCL3）、白介素（interleukin，IL）相關(guān)基因（IL18、IL32、IL6ST、IL20RB、IL6）、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor， TNF）相關(guān)基因（TNFSF14、TNFAIP、TNFRSF10D）、NOD樣受體基因（NAIP、NLRP3）、凋亡相關(guān)基因（CASP8、CASP1）及線粒體細(xì)胞色素相關(guān)基因（CYB5RL、CYCS、C

7、YP1B1、CYP2U1）等；
　?。?）對差異基因進(jìn)行GO分析表明LM49參與了及炎癥反應(yīng)和凋亡過程；
　?。?）對差異基因進(jìn)行KEGG分析表明LM49保護(hù)作用組與H2O2組所篩選的NOD樣受體信號通路在差異基因比例和差異的顯著性均較其它通路明顯；
　　（6）Western blot檢測結(jié)果表明LM49對H2O2誘導(dǎo)的EA.hy926細(xì)胞NOD1、NF-κB、ICAM-1、E-selectin表達(dá)及ERK1/2、p-

8、p38MAPK蛋白激酶磷酸化水平具有明顯抑制作用（p<0.05），且抑制作用呈明顯劑量關(guān)系；
　?。?）細(xì)胞免疫熒光法檢測結(jié)果表明LM49對H2O2誘導(dǎo)的EA.hy926細(xì)胞NF-κB核轉(zhuǎn)入水平具有明顯抑制作用，且抑制作用呈現(xiàn)一定的劑量關(guān)系；
　?。?）Annexin V-FITC/PI雙染實驗表明LM49在0、5、10和20μmol/L濃度時對H2O2誘導(dǎo)的EA.hy926細(xì)胞凋亡率分別為14.9％、12.5%、7.7%和

9、6.1%，表明LM49對H2O2誘導(dǎo)的EA.hy926細(xì)胞凋亡具有顯著抑制作用（p<0.05）；
　?。?）RT-PCR和Western blot檢測結(jié)果表明，LM49在5、10和20μmol/L濃度時顯著抑制H2O2誘導(dǎo)EA.hy926細(xì)胞內(nèi)促凋亡蛋白Bax和Bax mRNA表達(dá)及cleaved caspase-3表達(dá)的升高，同時抑制抑凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-2 mRNA表達(dá)的降低（p<0.05），且抑制作用呈明顯劑量關(guān)系；

10、
　?。?0）高糖高脂飼料結(jié)合STZ誘導(dǎo)建立糖尿病大鼠模型研究表明：LM49能夠降低糖尿病大鼠的血糖，降低糖尿病大鼠血清中NOD1、NF-κB、ICAM-1、IL-6、MDA的含量（p<0.05）及提高氧化還原酶SOD、GSH-Px的活性（p<0.05），初步表明LM49對糖尿病大鼠有一定的抗炎及抗氧化作用。
　　結(jié)論：
　?。?）LM49能夠抑制H2O2誘導(dǎo)的EA.hy926細(xì)胞損傷，差異基因和信號通路分析表明其作用

11、機(jī)制可能與抗凋亡和抗炎作用相關(guān)；
　?。?）LM49抑制H2O2誘導(dǎo)的EA.hy926炎癥反應(yīng)，與調(diào)控NOD1及下游NF-κB、MAPK炎癥信號通路有關(guān)；
　　（3）LM49抑制H2O2誘導(dǎo)的EA.hy926細(xì)胞凋亡，與調(diào)控Bcl-2和Bax基因、蛋白及cleaved caspase-3蛋白的表達(dá)相關(guān)；
　?。?）LM49具有降低糖尿病大鼠血糖，降低血清中NOD1、NF-κB、ICAM-1、IL-6及MDA含量，且提高