米糠粗黃酮抑制羥基自由基和Aβ誘導(dǎo)的SH-SY5Y凋亡的作用及機(jī)理研究.pdf

1、老年癡呆癥是常見(jiàn)的神經(jīng)退行性疾病，患者具有大腦萎縮、細(xì)胞外出現(xiàn)淀粉樣斑塊、細(xì)胞內(nèi)神經(jīng)纖維纏結(jié)、神經(jīng)元大量喪失，以及金屬離子的過(guò)量堆積等臨床病理特征。近年來(lái)的研究表明:金屬離子（如Cu2+）引起的氧化應(yīng)激和異常聚集的Aβ可能是導(dǎo)致AD的主要原因。具有氧化還原活性的Cu2+能催化產(chǎn)生自由基，破壞線(xiàn)粒體的正常生理功能，誘導(dǎo)細(xì)胞膜、組織和酶氧化損傷，最終導(dǎo)致神經(jīng)變性疾病;Aβ聚集形成的聚集物（寡聚體、纖維等）可以破壞細(xì)胞膜，引起炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致神

2、經(jīng)元凋亡。本文以米糠為原料，提取其中的粗黃酮，研究米糠粗黃酮對(duì)金屬離子引起的氧化應(yīng)激和異常聚集的Aβ導(dǎo)致的神經(jīng)毒性的影響。利用CCA熒光法、原子力顯微鏡、噻唑藍(lán)、MTT實(shí)驗(yàn)、Hoechst33258染色實(shí)驗(yàn)、DCFH-DA測(cè)內(nèi)源性RO實(shí)驗(yàn)、western blot實(shí)驗(yàn)探討了米糠粗黃酮（Crude flavonoids from Rice bran，F(xiàn)RB）抑制羥基自由基和Aβ誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞凋亡的作用及機(jī)理的初步研究。通過(guò)本論文

3、的研究發(fā)現(xiàn):
　　1.利用酶解輔助超聲的方法提取米糠粗黃酮并對(duì)其提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，米糠粗黃酮的提取率達(dá)到3.26％。HPLC初步檢測(cè)米糠粗黃酮中含有柚皮素成分，含量占4.47％。
　　2.米糠粗黃酮能減少Cu2+催化H2O2、 Cu2+誘導(dǎo)抗壞血酸(AA)產(chǎn)生的羥基自由基。CCA熒光實(shí)驗(yàn)表明米糠粗黃酮能分別使Cu2+催化H2O2、 Cu2+誘導(dǎo)AA產(chǎn)生的羥基自由基的量降低61.82％、57.46％。通過(guò)MTT實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)60μg

4、/mL的米糠粗黃酮使羥基自由基損傷的SH-SY5Y細(xì)胞的存活率由(25.97±2.06)％增加至(76.96±4.39)％。因此，米糠粗黃酮可以通過(guò)抑制羥基自由基的生成，從而抑制SH-SY5Y細(xì)胞的凋亡。
　　3.米糠粗黃酮能抑制Aβ(1-42)毒性聚集物的產(chǎn)生。利用AFM檢測(cè)發(fā)現(xiàn)米糠粗黃酮能減少Aβ(1-42)毒性聚集物（寡聚體、纖維前體、纖維）的產(chǎn)生，改變Aβ(1-42)的聚集路徑。在一定濃度范圍內(nèi)，米糠粗黃酮濃度越高，抑制A

5、β(1-42)聚集物生成的效果更明顯。
　　4.米糠粗黃酮能抑制Aβ(1-42)毒性聚集物誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞的凋亡。通過(guò)MTT和Hoechst33258實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)80μM Aβ(1-42)處理的細(xì)胞存活率為(52.25±1.34)％，且細(xì)胞呈極亮的藍(lán)色。120μM米糠粗黃酮使SH-SY5Y細(xì)胞的存活率由(52.25±1.34)％增加至(91.47±1.45)％，細(xì)胞極亮的藍(lán)光減少，細(xì)胞核形態(tài)呈均一飽滿(mǎn)狀。說(shuō)明米糠粗黃酮能明顯抑

6、制Aβ(1-42)誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞的凋亡。
　　5.米糠粗黃酮能減少細(xì)胞內(nèi)源性ROS和下調(diào)caspase-3，從而抑制Aβ(1-42)誘導(dǎo)SH-SYSY細(xì)胞的凋亡。通過(guò)DCFH-DA測(cè)細(xì)胞內(nèi)源性ROS發(fā)現(xiàn)，米糠粗黃酮使細(xì)胞內(nèi)源性ROS由1.72±0.02降低到1.12±0.04，從而保護(hù)SH-SY5Y細(xì)胞免受Aβ(1-42)誘導(dǎo)的損傷。western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明Aβ(1-42)能極顯著性(p＜0.01)的上調(diào)細(xì)胞

7、caspase-3的表達(dá)，而120μM的米糠粗黃酮使caspase-3的蛋白表達(dá)相對(duì)量由1.73±0.07降低到1.07±0.02。因此米糠粗黃酮可以通過(guò)下調(diào)caspase-3，從而抑制Aβ(1-42)誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞凋亡。
　　綜上，本文對(duì)米糠粗黃酮的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，并利用HPLC初步測(cè)定其成分;研究了米糠粗黃酮對(duì)羥基自由基和Aβ誘導(dǎo)SH-SY5Y凋亡的抑制作用，并對(duì)其機(jī)理進(jìn)行了初步探究;為米糠的綜合利用提供了新的研究