靶向c-Met嵌合抗原受體T細胞的制備及對鼻咽癌細胞作用的研究.pdf

1、研究背景:鼻咽癌(NPC)是我國高發(fā)的頭頸部惡性腫瘤之一，主要發(fā)病于我國的南方地區(qū)。但是由于其解剖位置較深和早期癥狀不典型，約80％的鼻咽癌患者在第一次就診時就已經發(fā)展到晚期。放療聯合以鉑類為基礎的化療為局部晚期鼻咽癌的標準治療方法，雖然局部和區(qū)域控制率有所改善，超過30％的患者仍然發(fā)生復發(fā)和遠處轉移。面臨這些挑戰(zhàn)，迫切需要發(fā)展新的治療策略，以提高局部晚期鼻咽癌患者的生存率。
　　最新研究結果表明，鼻咽癌的發(fā)生、發(fā)展、轉移與原癌基

2、因編碼的產物c-Met密切相關。c-Met蛋白屬于肝細胞生長因子受體家族，c-Met通過與配體肝細胞生長因子(HGF)結合，激活HGF/c-Met信號通路，降低細胞間的粘附力，有利于腫瘤細胞的轉移。因此，c-Met可以成為鼻咽癌靶向治療的潛在靶點。
　　嵌合抗原受體（CAR）T細胞是一種將抗體靶向治療和T細胞免疫治療相結合的治療方法。通過識別腫瘤表面抗原，帶領T細胞到達腫瘤周圍，發(fā)揮T細胞的免疫功能，實現識別并殺傷腫瘤細胞的能力。

3、是一種很有發(fā)展空間的治療腫瘤的策略。
　　本研究擬在實驗室已經制備好的抗c-Met Fab抗體的基礎上，利用基因工程技術構建靶向c-Met CAR逆轉錄病毒載體，轉染T淋巴細胞，制備c-MetCAR-T，觀察其對鼻咽癌細胞生物學特性的影響，為鼻咽癌治療提供新發(fā)法、新思路。
　　研究目的:
　　1.構建靶向c-Met的嵌合抗原受體逆轉錄病毒載體。
　　2.制備抗c-Met CAR-T;觀察c-Met CAR-T對于

4、c-Met陽性鼻咽癌細胞的增殖抑制作用;檢測c-Met CAR-T與c-Met陽性的鼻咽癌共培養(yǎng)后細胞因子IFN-γ、 IL-2的變化。
　　研究方法:
　　1.利用基因工程技術構建抗c-Met scFv，并將其重組到含有人IgG分子的CH2CH3以及CD28，CD137，CD3ζ等的逆轉錄病毒載體中，形成c-Met CAR逆轉錄病毒載體，經過測序檢測確認。
　　2.c-Met CAR逆轉錄病毒載體的感染293T細胞，

5、通過Western blotting檢測c-Met CAR在293T細胞中的表達。
　　3.c-Met CAR逆轉錄病毒的包裝后感染T淋巴細胞，通過Western blotting檢測c-Met CAR在T淋巴細胞中的表達。
　　4.通過流式、RT-PCR、Western Blotting方法篩選出表達c-Met的鼻咽癌細胞株，以及不表達c-Met的腫瘤細胞株。
　　5.通過CCK-8法檢測c-Met CAR-T細胞和

6、對照組CD19 CAR-T、未轉染T細胞與鼻咽癌細胞株CNE2、HONE1共培養(yǎng)4h、12h、24h后，對鼻咽癌細胞株的增殖抑制作用。
　　6.c-MetCAR-T與鼻咽癌細胞共培養(yǎng)24h后，通過ELISA法檢測細胞因子IFN-γ、IL-2的變化。
　　研究結果:
　　1.經PCR擴增、優(yōu)化、酶切，連接等方法構建c-Met CAR逆病毒載體，經測序檢測序列正確。
　　2.c-Met CAR逆轉錄病毒載體感染293

7、T細胞，裂解蛋白，Western Blotting檢測到抗人CD3ζ抗體的表達，與預期大小一致。結果說明所構建的重組質粒能夠在293T細胞中表達，293T細胞能夠用于病毒包裝。
　　3.c-Met CAR逆轉錄病毒感染T淋巴細胞，裂解蛋白，Western Blotting檢測到抗人內源性、外源性人CD3ζ抗體的表達分別為22KD、76KD，與預期大小一致。結果說明所構建的重組質粒能夠在T淋巴細胞中表達，成功制備c-MetCAR-T

8、。
　　4.通過流式、RT-PCR、Western Blotting成功篩選出表達c-Met的鼻咽癌細胞株CNE2和HONE1，以及不表達c-Met的對照組卵巢癌細胞株HO8910。
　　5.CCK-8結果顯示c-Met CAR-T與鼻咽癌細胞分別共培養(yǎng)4h、12h、24h，4h時殺傷率最高。隨著T細胞與腫瘤細胞比例的增加，對于腫瘤細胞的抑制作用就越明顯。當比例為20∶1時，殺傷率最高，c-Met CAR-T細胞對鼻咽癌細胞

9、株CNE2、HONE1的殺傷率分別為60.33±3.73％、61.33±4.73％。而對于對照組CD19CAR-T組和未轉染的T細胞組(UTD)對HONE1、CNE2的殺傷率僅僅分別為27.67±0.94％、26.67±0.47％，30.67±1.70％、28.13±0.50％。相比差別有統(tǒng)計學意義。
　　6.ELISA結果顯示c-Met CAR-T與c-Met陽性的鼻咽癌細胞株共培養(yǎng)后分泌細胞因子IFN-γ、IL-2明顯增加;而