靶向間皮素的嵌合抗原受體修飾T細(xì)胞(mesoCAR-T)治療肝癌的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、癌癥現(xiàn)在已成為人類健康的頭號(hào)殺手，世界范圍內(nèi)，肝癌發(fā)病率在所有癌癥中居第六位，每年約有750萬(wàn)新增病例，死亡率高居第三位?？焖俚纳罟?jié)奏、巨大的工作壓力、不健康的飲食習(xí)慣、糟糕的環(huán)境都是癌癥發(fā)生的幫兇，使得癌癥的高發(fā)率和年輕化趨勢(shì)也越來越明顯。早期肝癌進(jìn)行有效治療后五年生存率能達(dá)到50％–70%。但是由于肝癌早期診斷技術(shù)的限制，肝癌總的五年生存率只有10%。目前常用的治療手段主要包括手術(shù)切除、肝臟移植、化療、化療栓塞、射頻消融、質(zhì)子射線

2、療法等，但效果十分有限。因此，仍需探索一個(gè)更加有效的治療方法，來提高肝癌生存率和生存質(zhì)量。近年來免疫療法的興起，即利用自身免疫系統(tǒng)來抵御癌癥，給癌癥患者帶來了新的希望。
　　然而，癌癥患者自身的免疫系統(tǒng)受損嚴(yán)重，狡猾的腫瘤細(xì)胞又會(huì)通過MHC分子的低表達(dá)或不表達(dá)來逃脫免疫細(xì)胞的攻擊，這些都給治療帶來了很大困難。因此，精密制導(dǎo)、精準(zhǔn)打擊的免疫細(xì)胞武器—CAR-T技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生。
　　CAR-T細(xì)胞，即嵌合型抗原受體修飾的T細(xì)胞，這

3、種通過基因修飾T細(xì)胞的過繼性免疫細(xì)胞療法，可以克服MHC介導(dǎo)的免疫逃逸機(jī)制，快速建立腫瘤免疫并消除小型或大型腫瘤負(fù)擔(dān)，被認(rèn)為是一種很有前景的治療策略。尤其是靶向CD19的CAR-T細(xì)胞在惡性血液病中取得的巨大成功，開創(chuàng)了腫瘤生物治療的新紀(jì)元。
　　CAR-T技術(shù)雖在惡性血液病中獲得驚人效果，運(yùn)用到實(shí)體瘤時(shí)卻處處碰壁，除了實(shí)體瘤更加復(fù)雜的腫瘤抑制微環(huán)境外，還面臨著很多問題：缺乏類似于CD19這樣特異的靶點(diǎn)，轉(zhuǎn)染效率不高，CAR的數(shù)量

4、和CAR的親和力等。本文構(gòu)建并檢測(cè)了針對(duì)間皮素的第二代CAR T細(xì)胞對(duì)幾種肝癌細(xì)胞株的體外殺傷作用：
　　(1)構(gòu)建包含CD3ζ和4-1BB兩個(gè)胞內(nèi)共刺激區(qū)的mesoCAR，通過piggyBac轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)轉(zhuǎn)染T細(xì)胞，獲得mesoCAR-T細(xì)胞。替代常用的慢病毒載體轉(zhuǎn)染方式，其陽(yáng)性率可達(dá)到66%。流式檢測(cè)K562-meso刺激下mesoCAR-T的活化表型（CD137，CD28，CD27，CD134，CD38，CD107α），結(jié)果顯

5、示mesoCAR-T細(xì)胞可被K562-meso細(xì)胞激活。
　　(2)通過RT-PCR、Western Blot檢測(cè)多種腫瘤細(xì)胞株間皮素的表達(dá)水平，并人工構(gòu)建間皮素高表達(dá)細(xì)胞株。篩選出了四種不同表達(dá)水平的肝癌細(xì)胞株，檢測(cè)mesoCAR-T細(xì)胞對(duì)高表達(dá)（SMMC-7721、BEL-7404）及低表達(dá)細(xì)胞株（HepG2、Huh7）的殺傷作用差異。結(jié)果顯示mesoCAR-T細(xì)胞對(duì)間皮素高表達(dá)細(xì)胞株的殺傷作用明顯強(qiáng)于低表達(dá)或不表達(dá)間皮素的細(xì)

6、胞株，表明構(gòu)建的mesoCAR-T細(xì)胞具有一定的特異性。
　　(3)通過檢測(cè)mesoCAR-T細(xì)胞的細(xì)胞因子發(fā)現(xiàn)，IFN-γ、TNF-α、IL2的分泌明顯高于對(duì)照組T細(xì)胞。mesoCAR-T與腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)IFN-γ的分泌量與腫瘤細(xì)胞株間皮素的表達(dá)量也基本成正比關(guān)系。
　　(4)SMMC-7721小鼠移植瘤模型中，與PBS和control T細(xì)胞組相比，mesoCAR-T細(xì)胞治療組對(duì)腫瘤的抑制作用更強(qiáng)，且能在體內(nèi)更好地增殖。