嵌合抗原受體修飾的NK細(xì)胞在多發(fā)性骨髓瘤中的應(yīng)用研究.pdf

1、多發(fā)性骨髓瘤(Multiple Myeloma，MM)是一種漿細(xì)胞系統(tǒng)惡性克隆性疾病，主要特征為漿細(xì)胞克隆性增值并導(dǎo)致血和尿中出現(xiàn)大量免疫球蛋白M蛋白。目前治療主要根據(jù)患者的危險(xiǎn)度分層進(jìn)行個(gè)體化治療，雖然新藥如免疫調(diào)節(jié)劑及蛋白酶體抑制劑的使用延長了患者的生存期，但大部分患者最終疾病會復(fù)發(fā)，因而就需要更新的治療藥物及方法。嵌合抗原受體(chimeric antigen receptors，CARs)修飾的淋巴細(xì)胞治療惡性腫瘤是一種新的免疫

2、治療方法。前期研究發(fā)現(xiàn)嵌合抗原受體修飾的NK細(xì)胞具有抗骨髓瘤效應(yīng)，為臨床使用該項(xiàng)技術(shù)提供了理論依據(jù)。 目的:該研究主要探討嵌合抗原受體設(shè)計(jì)的NK細(xì)胞的抗骨髓瘤效應(yīng)
　　方法:
　　本研究首先提取Jurkat細(xì)胞的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，通過PCR的方法合成CD28片段和CD3ζ片段，紫外光下切膠回收片段，通過雙酶切連接的方法使每個(gè)片段連接到pcDNA3.1質(zhì)粒，抗CD138scFv片段由我院生物治療科提供片段由基

3、因公司合成并連接到pcDNA3.1質(zhì)粒，DNA測序正確后繼續(xù)雙酶切連接的方法使三個(gè)片段首尾彼此相連成融合片段，測序正確后，雙酶切片段回收連接到pHBLV-CMVIE-Luc-T2A-puro質(zhì)粒，通過三質(zhì)粒慢病毒包裝系統(tǒng)(pSPAX2，pMD2G，pHBLV-CMVIE-Luc-T2A-puro)轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，收集病毒并測定病毒滴度，接著使用病毒感染NK92MI細(xì)胞系，并通過嘌呤霉素篩選陽性細(xì)胞株，建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株后，通過PCR及

4、Western Blot驗(yàn)證CAR(抗CD138-CD28-CD3ζ)在NK92MI細(xì)胞系的表達(dá)，驗(yàn)證正確后進(jìn)行細(xì)胞試驗(yàn)。在細(xì)胞試驗(yàn)中，通過流式細(xì)胞儀檢測NK92MI細(xì)胞分泌細(xì)胞因子cd107a的能力，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。從而在細(xì)胞水平驗(yàn)證CAR-NK細(xì)胞的抗骨髓瘤作用。
　　結(jié)果:
　　①通過基因工程技術(shù)，體外構(gòu)建CAR基因片段，通過基因測序驗(yàn)證基因序列正確。
　　②經(jīng)過病毒包裝技術(shù)，獲得表達(dá)該片段的病毒株。
　

5、?、劢?jīng)過病毒轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，獲得表達(dá)CAR融合蛋白的穩(wěn)轉(zhuǎn)NK細(xì)胞株。
　?、芙?jīng)PCR及Western Blot證實(shí)CAR融合蛋白在NK細(xì)胞表達(dá)。
　?、菁?xì)胞殺傷實(shí)驗(yàn)證實(shí)CARNK細(xì)胞具有明顯的殺傷多發(fā)性骨髓瘤的效應(yīng)，CARNK細(xì)胞分泌細(xì)胞因子cd107a的能力明顯優(yōu)于對照組。
　　結(jié)論:
　?、貱AR(抗CD138-CD28-CD3ζ)能在體外構(gòu)建并在NK92細(xì)胞表面表達(dá)
　?、贑AR NK細(xì)胞能殺傷表達(dá)cd13