腎癌T細胞受體庫深度測序的實驗研究.pdf

1、背景及目的：
　　腎細胞癌（Renal cell carcinoma，RCC）是腎臟最常見的惡性腫瘤，約占腎臟所有腫瘤的85％。腎臟的細胞癌來源于腎臟的腎小管上皮，其中最為常見的是腺癌。每年會有209000腎癌新發(fā)病例，因腎癌而死亡的人數(shù)高達102000人。腎癌的手術(shù)切除仍是當(dāng)前最理想和最好的減瘤方法，是治療晚期和轉(zhuǎn)移性腎臟細胞癌的可選的方法之一，但是容易復(fù)發(fā)。由于腎癌對放化療不敏感，導(dǎo)致放化療對患有腎癌的病人治療效果不佳。根據(jù)以

2、往的研究，我們知道腎癌有著非常特殊的生物學(xué)行為，例如，腎癌病灶可以自發(fā)的消退，而且偶爾還能觀察到腎癌的轉(zhuǎn)移病灶會長期處于休眠狀態(tài)。經(jīng)過調(diào)查研究發(fā)現(xiàn)，人體的免疫體統(tǒng)在排斥腫瘤的免疫細胞反應(yīng)中起到關(guān)鍵作用。因此，免疫治療（主動免疫、被動免疫、特異性和非特異性）似乎成為治療腎癌的有效方法。在腫瘤細胞內(nèi)，由于體細胞異?；蛲蛔兊姆e累，而導(dǎo)致細胞表達異常的抗原，并呈現(xiàn)在腫瘤細胞表面，這是一個病理性遺傳改變的結(jié)果。腫瘤內(nèi)浸潤的T細胞（TIL）能夠特

3、異性的識別這些表達異?？乖募毎⒖梢杂|發(fā)抗腫瘤的獲得性免疫反應(yīng)。然而，來源于同一組織類型的腫瘤細胞也會呈現(xiàn)出不同類型的腫瘤相關(guān)抗原表位，在腫瘤復(fù)雜的微環(huán)境下，這些多樣性的腫瘤表面抗原能夠誘導(dǎo)特異性異質(zhì)性的T細胞浸潤，其中衡量浸潤的異質(zhì)性的T細胞主要指標(biāo)是浸潤強度、T細胞亞型的組成和不均勻的空間分布。
　　CD8+的腫瘤浸潤 T細胞能夠直接介導(dǎo)腫瘤相關(guān)抗原的識別和細胞毒性反應(yīng)，人們對CD8+T細胞的功能已有了很好的了解。然而，對

4、于CD4+的T細胞來說，由于他們在腫瘤灶內(nèi)多樣的亞型和多變的生物學(xué)特性，使得人們還有很多關(guān)于CD4+T細胞未知的東西等待探索。自體的CD4+TIL的輔助功能可能是增強和維持TAA-激活的CD8+T細胞的有效細胞毒性反應(yīng)。同時，近幾年研究發(fā)現(xiàn)CD4+TILs可以在CD8+T細胞缺失的情況下，通過PRF1/GZMB或Th1/M1樣巨噬細胞依賴的機制單獨殺傷腫瘤細胞。因此，了解哪一種類型的腫瘤內(nèi)進浸潤的T細胞在腫瘤的刺激下而活化和決定抗原特異

5、性選擇的因素都將是非常有趣且很有意義的研究，為病人的個體化治療帶來全新的方法。
　　人體的免疫系統(tǒng)能夠有效的識別眾多的腫瘤相關(guān)抗原，主要得益于T細胞表面多樣性的受體TCR，TCR是早期在胸腺中TCRA和TCRB位點基因隨機重組形成的。位于TCR上的互補決定區(qū)3 CDR3是識別異?？乖慕Y(jié)合點，CDR3決定了TCR的特異性和識別抗原結(jié)合區(qū)域的長度，同時影響TCR受體庫的多樣性使TCR受體能夠識別各種不同的抗原。腫瘤特異性的T細胞有效

6、的活化和后來的擴增，隨之會帶來多樣性的特異的TCR的表達。因此，如果能夠量化這些擴增的TCR克隆的類型，將為人們理解和應(yīng)用好腫瘤特異性T細胞反應(yīng)帶來革命性的突破。近年來，人們應(yīng)用高通量測序的方法分析免疫系統(tǒng)的免疫組庫，為人們了解免疫體統(tǒng)提供了更清晰的觀點。高通量的測序技術(shù)目前主要應(yīng)用于克隆的追蹤、分析免疫受體庫的特點和識別定義常見的克隆。我們的實驗研究主要是利用多重PCR技術(shù)分析和測序T細胞的CDR3區(qū)域，其中T細胞主要來源于10個腎癌

7、病人腫瘤內(nèi)浸潤的T細胞、癌旁內(nèi)的T細胞和外周血T細胞。通過高通量的深度測序技術(shù)來建立腎癌內(nèi)特殊的腫瘤微環(huán)境和TIL受體庫之間的聯(lián)系。
　　這里我們應(yīng)用高通量測序的方法分別對腎癌病人腫瘤病灶內(nèi)、癌旁組織和外周血內(nèi)T細胞進行測序，分析CD4+/CD8+ TIL的特點。通過對比我們主要想解決一下問題：1.分析T細胞受體庫中TCRB上V/J基因片段的使用特征，2.腫瘤內(nèi)是否存在高頻擴增的T細胞，并確定其亞型，3.受體庫多樣性的變化，4.若

8、存在高頻的T細胞克隆，是否為抗原所驅(qū)動，5.腫瘤內(nèi)活化的T細胞來源于癌旁or外周血，6.病人間腫瘤內(nèi)是否存在相同的抗原.
　　材料和方法：
　　取未經(jīng)過其他免疫治療的腎癌病人的標(biāo)本，包括腫瘤組織、癌旁組織和外周血。用酶消化法處理腫瘤組織和癌旁組織，消化所得到的細胞用濃度40%和80%的Percoll進行濃度梯度離心得到組織內(nèi)淋巴細胞。同時用淋巴細胞分離液分出外周血中的淋巴細胞。有磁珠分選法，將得到的淋巴細胞分選為CD4+T細

9、胞和CD8+T細胞并分別放置于不同的Trizol中進行處理。接著分別提取CD4+T和CD8+T細胞的RNA，將得到的RNA進行逆轉(zhuǎn)錄擴增得到相對穩(wěn)定的cDNA，再將得到的cDNA進行PCR擴增反應(yīng)。隨后進行電泳實驗，來驗證PCR產(chǎn)物是否為自己所需，若得到了自己所需的條帶后，將瓊脂糖膠條帶切下進行膠的回收處理，重新分離出所需的目的DNA并保存。將保存的DNA樣本經(jīng)過TCR深度測序儀處理的到原始的TCR代碼，將原始的代碼用數(shù)學(xué)軟件MATLA

10、B進行數(shù)據(jù)的分析和處理。
　　結(jié)果：
　　成功的分離篩選得到病人癌組織、癌旁組織和外周血內(nèi)的CD4+和CD8+ T細胞，成功的通過逆轉(zhuǎn)錄和PCR擴增得到所需的目的條帶并經(jīng)膠回收得到所需樣本。樣本順利的經(jīng)過測序處理分析后得到的原始代碼結(jié)果MATLAB處理后我們發(fā)現(xiàn)：1）腎癌腫瘤內(nèi)CD4 T細胞TRBV/J基因片段特征與癌旁組織內(nèi)顯著不同；2）腎癌腫瘤內(nèi)包含高頻率擴增CD4 T細胞克隆而CD8+T沒有此現(xiàn)象；3）腫瘤內(nèi)CD4 T

11、細胞受體庫多樣性降低；4）腫瘤內(nèi)CD4 T細胞擴增呈現(xiàn)抗原驅(qū)動特征；5）腫瘤內(nèi)高頻率CD4 T細胞主要來源于癌旁組織；6）腫瘤內(nèi)CD4 T細胞呈現(xiàn)異質(zhì)的抗原特異性擴增。
　　結(jié)論：
　　1.成功的應(yīng)用TCR深度測序的技術(shù)測量了腎癌病人的癌組織、癌旁組織、和外周血中CD4+/CD8+T細胞的受體庫。
　　2.CD4+腫瘤內(nèi)浸潤的淋巴細胞（TIL）受體庫表現(xiàn)為TRBV/J片段不同的使用，而CD8+TIL無明顯差異。