高通量深度測(cè)序繪制系統(tǒng)性紅斑狼瘡CD4+T細(xì)胞全基因組MicroRNAs表達(dá)譜.pdf

1、系統(tǒng)性紅斑狼瘡(Systemic lupus erythematosus,SLE)是一種涉及多個(gè)器官和系統(tǒng)的慢性自身免疫性疾病,以產(chǎn)生多種自身抗體為特征,其臨床表現(xiàn)具有多樣性,包括面部蝶形紅斑、光敏感、關(guān)節(jié)炎和腎損害等。近幾十年來(lái),由于診斷和治療水平的提高,大部分SLE患者的5年生存率均可以超過(guò)90％,但是長(zhǎng)期的隨訪研究顯示SLE導(dǎo)致器官受損的情況下,尤其是在腎功能衰竭和心血管疾病的案例中,患者的生存狀況仍不容樂(lè)觀。SLE的發(fā)病機(jī)制和具

2、體病因迄今不明,遺傳和性激素可能與SLE發(fā)病有關(guān),但僅用遺傳和性激素因素不能完全解釋SLE的發(fā)病機(jī)制。近年來(lái)的研究結(jié)果表明異常的表觀遺傳調(diào)控包括DNA甲基化、組蛋白修飾、microRNAs(miRNAs)在SLE的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用,而CD4+T細(xì)胞過(guò)度活化也是SLE發(fā)病機(jī)制的特點(diǎn)之一。本課題組先前的研究發(fā)現(xiàn)miR-126對(duì)于SLECD4+T細(xì)胞甲基化具有調(diào)控作用,推測(cè)其余眾多的miRNAs也可能與miR-126類似,參與SLE發(fā)生

3、和發(fā)展。
　　miRNA在1993年即被發(fā)現(xiàn),但是2005年之后才逐步成為表觀遺傳學(xué)范疇的研究熱點(diǎn)。它們是一類長(zhǎng)度約19-25核苷酸(nt)的內(nèi)源性單鏈非編碼小RNA分子?，F(xiàn)已有多項(xiàng)研究證實(shí)miRNAs參與人體生長(zhǎng)發(fā)育等多種生物學(xué)進(jìn)程,部分miRNAs異常表達(dá)可誘導(dǎo)自身免疫反應(yīng)。
　　近年來(lái),miRNAs表達(dá)檢測(cè)技術(shù)飛速發(fā)展,其中miRNA高通量深度測(cè)序獲得了廣泛關(guān)注,研究者們將此項(xiàng)技術(shù)與其他多種實(shí)驗(yàn)方法聯(lián)合使用使越來(lái)越多的

4、miRNA功能得到證實(shí)。與局限性較大的第一代Sanger測(cè)序相比,第二代測(cè)序技術(shù)具有高通量、高質(zhì)量、省時(shí)省力和操作平臺(tái)簡(jiǎn)易等優(yōu)勢(shì),是鑒定樣品中已知和未知miRNA,并進(jìn)行差異性分析的重要工具。目前第二代大規(guī)模測(cè)序技術(shù)主要包括454焦磷酸測(cè)序、Solexa合成測(cè)序和SOLiD連接測(cè)序3種,其應(yīng)用均在DNA和RNA水平的多項(xiàng)研究中占據(jù)優(yōu)勢(shì)。
　　因此,本實(shí)驗(yàn)通過(guò)利用Solexa測(cè)序來(lái)篩選正常人和不同臨床表型的SLE患者CD4+T細(xì)胞中

5、差異表達(dá)rniRNAs,并采用Real-timeqPCR擴(kuò)大樣本量驗(yàn)證測(cè)序結(jié)果,初步繪制不同表型的SLE患者CIM+T細(xì)胞miRNAs表達(dá)譜,為深入探討SLE患者器官受累的分子機(jī)制奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　第一部分 SLE CD4+T細(xì)胞microRNAs高通量深度測(cè)序
　　目的：篩選正常人和不同器官受累的SLE CD4+T細(xì)胞中差異表達(dá)的miRNAs。
　　方法
　　1.收集4例正常人和12例SLE患者(皮膚型4例,

6、皮膚和腎臟受累型4例,皮膚、腎臟及關(guān)節(jié)受累型4例)外周血,密度梯度離心分離單個(gè)核細(xì)胞,進(jìn)一步利用CD4磁珠分離CD4+T細(xì)胞;
　　2.Trizol法提取各樣本總RNA,每組4例樣本均勻混合成一個(gè)pool,共產(chǎn)生4個(gè)測(cè)序樣本pool,正常對(duì)照標(biāo)記為NC,另3個(gè)根據(jù)SLE患者器官受累不同,分別標(biāo)記為S(皮膚)、SK(皮膚+腎臟)和SKJ(皮膚+關(guān)節(jié)+腎臟);
　　3.Solexa測(cè)序檢測(cè)來(lái)自正常人和SLE患者CD4+T細(xì)胞中多

7、種miRNAs表達(dá)水平并進(jìn)行差異分析。
　　結(jié)果：每個(gè)樣本測(cè)序約產(chǎn)生1,000,000reads,長(zhǎng)度區(qū)間在21-23nt的miRNAs約占所有小RNA總量的60％。通過(guò)4組樣本兩兩比較分析,我們發(fā)現(xiàn)與正常對(duì)照相比,有38個(gè)miRNAs在S組、SK組和SKJ組中表達(dá)均顯著上調(diào),2個(gè)miRNAs表達(dá)均下調(diào)(10g2-ratio＞1或＜-1;P＜0.01)。測(cè)序結(jié)果顯示:①與正常對(duì)照組相比,SLE患者組的miR-126和miR-181

8、b表達(dá)水平均顯著上調(diào),相反miR-142-3p和miR-505在患者組均顯著下調(diào),差異均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);miR-451在S組和SK組顯著上調(diào)(P＜0.01),在SKJ組上調(diào)但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.0857)。②不同臨床表型SLE患者組內(nèi)兩兩比較顯示:miR-126和miR-181b的表達(dá)水平按照S＞SKJ＞SK的梯度顯著升高(P＜0.01或＜0.05);miR-451在S組的表達(dá)量顯著高于SK組和SKJ組且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意

9、義(P＜0.01),但在SK組和SKJ組兩組之間miR-451表達(dá)水平無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.0528);miR-142-3p的表達(dá)水平按照S＜SK＜SKJ的梯度變化,且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);miR-505的表達(dá)水平無(wú)顯著改變(P＞0.05)。
　　結(jié)論
　　1.通過(guò)高通量測(cè)序,我們篩選到大量miRNAs在SLE患者CD4+T細(xì)胞中表達(dá)異常,如miR-126、miR-181b、miR-451、miR-142-3p、m

10、iR-505等,這些miRNAs可能與SLE的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)。
　　2.通過(guò)不同臨床表型組的兩兩比較分析,初步推測(cè)miR-126和miR-142-3p等可能與SLE患者多器官受累相關(guān)。
　　第二部分部分microRNA測(cè)序結(jié)果的驗(yàn)證
　　目的：擴(kuò)大樣本數(shù)量,利用RT-qPCR驗(yàn)證不同臨床表型SLE患者和正常對(duì)照CD4+T細(xì)胞中miR-126、miR-181b、miR-451、miR-142-3p、miR-505表達(dá)水平

11、。
　　方法：收集10例正常人及30例SLE患者(S、SK、SKJ組各10例)外周血CD4+T細(xì)胞,采用第一節(jié)相同的方法獲得每個(gè)人的總RNA,利用商品化引物通過(guò)RT-qPCR檢測(cè)正常人和SLE患者miR-126、miR-181b、miR-451、miR-142-3p、miR-505表達(dá)水平。
　　結(jié)果：與正常對(duì)照組相比,SLE患者CD4+T細(xì)胞中miR-126、miR-181b、miR-451在3個(gè)患者組均顯著上調(diào),miR-

12、142-3p、miR-505均顯著下調(diào)(P＜0.05),與測(cè)序結(jié)果一致。進(jìn)一步,兩兩比較不同臨床表型SLE患者CD4+T細(xì)胞中miRNAs表達(dá)差異。結(jié)果顯示:miR-126在SKJ組的表達(dá)水平顯著高于S組和SK組(P＜0.05),而其表達(dá)水平在S組和SK組的中無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。miR-181b在S組的表達(dá)高于SK組和SKJ組且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),但是其表達(dá)在SK組和SKJ組的比較中無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。mi

13、R-451的表達(dá)差異在各患者組之間的兩兩比較中均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01或0.05)且表達(dá)量按照SKJ＞SK＞S的梯度升高。miR-142-3p表達(dá)水平在SKJ組較S組和SK組顯著降低(P＜0.01)。在各患者組之間的兩兩比較中,miR-505的表達(dá)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　結(jié)論
　　1.Real-time qPCR的驗(yàn)證和高通量測(cè)序結(jié)果基本一致,提示miR-126、miR-18lb、miR-451、miR