海洋酒精酵母的篩選及酒精酵母菌W0的遺傳改造.pdf

1、隨著地球上化石能源的日趨枯竭和環(huán)境保護(hù)意識(shí)的不斷加強(qiáng),用燃料酒精取代部分汽油已經(jīng)成為一項(xiàng)重要的策略。目前,酒精的生產(chǎn)主要是通過(guò)酒精酵母對(duì)淀粉質(zhì)或糖質(zhì)原料的發(fā)酵來(lái)實(shí)現(xiàn)。酒精酵母最終的酒精產(chǎn)量受多種因素復(fù)雜調(diào)控,最顯著的是發(fā)酵過(guò)程中高濃度酒精對(duì)細(xì)胞的毒害作用。在發(fā)酵過(guò)程中,隨著發(fā)酵液中酒精濃度的增加,乙醇破壞細(xì)胞膜,損壞功能蛋白,逐漸導(dǎo)致酒精酵母菌的死亡。
　　 海洋覆蓋率占地球面積的71％,是個(gè)巨大的寶庫(kù)。海洋環(huán)境物種豐富,有許多

2、未發(fā)現(xiàn)但是可以利用提高人們生活質(zhì)量的物種,合理開發(fā)利用海洋資源已經(jīng)被各個(gè)國(guó)家提上日程。實(shí)驗(yàn)室從中國(guó)沿海采樣得到1000多株海洋酵母菌,經(jīng)過(guò)生理生化實(shí)驗(yàn)及分子生物學(xué)鑒定,只有17株是酒精酵母菌。這17株酒精酵母菌主要分布在渤海、東海和南海,而采自黃海的樣品中沒有發(fā)現(xiàn)。其中5株產(chǎn)酒精能力較強(qiáng),為Saccharomyces cerevisiaes2E00400、2E00498、2E00558、2E00723、2E00724,這5株菌都是采自渤

3、海。這種特殊的地域分布目前還沒有合理的解釋。在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),這些酒精酵母中,分離自渤海的菌株產(chǎn)酒精能力比其它地域的菌株強(qiáng),而所有分離白海洋環(huán)境中的酒精酵母菌其發(fā)酵能力都不如高產(chǎn)酒精的對(duì)照菌株酒精酵母菌(Saccharomyces sp.)W0強(qiáng)。
　　 環(huán)境脅迫下酒精酵母的耐受能力是考驗(yàn)一株酒精酵母能否作為工業(yè)菌種是否成熟的重要標(biāo)志,同時(shí)選育耐性酵母菌株提高發(fā)酵能力也是當(dāng)前的研究熱點(diǎn)之一。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)與菌種庫(kù)中產(chǎn)酒精能力較高的菌株相

4、比,發(fā)現(xiàn)產(chǎn)酒精能力最高的Saccharomyces sp.W0并不是耐受酒精能力最強(qiáng)的菌株,在18％(v／v)的酒精環(huán)境下培養(yǎng)2h后,W0菌株只有39％的生存率,而相同條件下2E00498菌株則可以達(dá)51％的生存率。由于酵母菌的耐酒精能力和細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的海藻糖的量有直接關(guān)系,測(cè)定了產(chǎn)酒精能力較高的酒精酵母菌株的海藻糖產(chǎn)量,發(fā)現(xiàn)W0菌株的海藻糖含量比2E00498菌株少31.5％。
　　 本實(shí)驗(yàn)室扣囊復(fù)膜酵母(Saccharomyc

5、opsis fibuligera)A11能夠產(chǎn)生24.8％(w／w)海藻糖,分泌高含量的蛋白酶,意味著這株菌能夠有很高的海藻糖合成酶活性。而扣囊復(fù)膜酵母和酒精酵母的海藻糖合成途徑是一樣的,克隆出S.fibuligera All中海藻糖合成酶的編碼基因TPS1,構(gòu)建了表達(dá)載體pMIRSC11—TPS1,經(jīng)NotI線性化酶切后轉(zhuǎn)化進(jìn)Saccharomyces sp.W0的尿嘧啶缺陷型菌株W12d中,得到重組子Saccharomyces sp

6、.Z8。經(jīng)過(guò)測(cè)定,發(fā)現(xiàn)重組子相對(duì)于W0來(lái)說(shuō),產(chǎn)酒精能力和耐酒精能力都有了提高。產(chǎn)海藻糖最高的重組菌株Z8,它的海藻糖含量比對(duì)照菌株W0高出近30％,海藻糖合成酶活力比WO菌株高33％。每克細(xì)胞的發(fā)酵能力方面Z8菌株最終減重達(dá)到36(g／g),而WO菌株只有27(g／g)。發(fā)酵過(guò)程中每天測(cè)定平行樣中海藻糖的含量,發(fā)現(xiàn)W0菌株比Z8菌株要低,這可能和Z8菌株的產(chǎn)酒精能力更強(qiáng)一些有關(guān)。對(duì)兩者進(jìn)行高濃度酒精的沖擊試驗(yàn),重組子Z8在18％(v／v