酵母菌遺傳課件

1、酵母菌遺傳,酵母菌概述,酵母菌：一種單細(xì)胞真菌，屬于兼性厭氧菌；個(gè)體形態(tài)有球狀、卵圓、橢圓、柱狀和香腸狀等。酵母菌具有典型的真核細(xì)胞結(jié)構(gòu)，有細(xì)胞壁、細(xì)胞膜、細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)、液泡、線粒體等，酵母菌雖屬于真核微生物，同時(shí)又具有原核生物的某些特征，例如形成菌落特征與細(xì)菌相似，生長(zhǎng)速度快等。1996年完成釀酒酵母全基因組的測(cè)序，是當(dāng)時(shí)完成測(cè)序的最大基因組，也是真核生物中第一個(gè)被測(cè)序的生物。,,,一、酵母菌的基因組和染色體二、酵母線粒體基因

2、組及其遺傳三、酵母菌中的質(zhì)粒四、酵母基因表達(dá)的調(diào)控五、接合型基因及其基因型轉(zhuǎn)換六、酵母菌的載體系統(tǒng)七、酵母雙雜交系統(tǒng),第一節(jié) 酵母菌的基因組和染色體一、酵母菌的基因組,1. 釀酒酵母的單倍體細(xì)胞含有16條染色體，總長(zhǎng)度為12068kb，其中第Ⅰ條染色體最短(230kb )，第Ⅳ條染色體最長(zhǎng)(1532kb) 。2. 基因組中沒有明顯的操縱子結(jié)構(gòu)，有間隔區(qū)和內(nèi)含子。3. 釀酒酵母染色體基因組中，有5885個(gè)可能是編碼

3、蛋白質(zhì)的ORF，每個(gè)ORF約為1.4kb，而基因間的平均間隔為600bp。（這說明酵母基因比其它高等真核生物基因排列緊密。）4.基因組含有52個(gè)完整的Ty因子（反轉(zhuǎn)座子）。,第一節(jié) 酵母菌的基因組和染色體,1.核小體：DNA和組蛋白（H2A、H2B、H3和H4）釀酒酵母中無H1（有絲分裂中維持染色質(zhì)的高度超螺旋）2.著絲粒（centromere）:點(diǎn)著絲粒和區(qū)域著絲粒3.端粒(telomere)：末端重復(fù)序列和蛋白質(zhì)4.復(fù)

4、制起點(diǎn)：控制DNA復(fù)制起始的一段DNA序列—ARS ARS若克隆到質(zhì)粒中，可使質(zhì)粒DNA在酵母中自主復(fù)制。 1）ARS的結(jié)構(gòu) A：ACS在所有的ARS都完全相同或相似 ARS B：ACS的3’末端 C：A,1.著絲粒,概念 著絲粒是真核細(xì)胞染色體DNA上的一段特殊序列。在有絲分裂和減數(shù)分裂時(shí)，紡錘絲與著絲粒結(jié)合，將染色體拉向細(xì)胞的兩極。主要類型：點(diǎn)著絲粒（著絲粒序列很短

5、釀酒酵母） 區(qū)域著絲粒（著絲粒序列較長(zhǎng) 脈胞菌、果蠅、人 ）,1.著絲粒,在釀酒酵母中，所有染色體的CEN序列的長(zhǎng)度均大于130bp，由5′→3′依次分為 CDEⅠ、CDEⅡ和CDEⅢ三個(gè)區(qū)。 CDEⅠ和CDEⅢ是兩個(gè)共有序列，位于兩側(cè)，中間是CDEⅡ，CDEⅡ的核苷酸序列中（A+T）含量超過90％，所以容易彎曲。,2.端粒,端粒是真核生物線性染色體兩端的特殊DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合體結(jié)構(gòu)，

6、這種復(fù)合體結(jié)構(gòu)是由 DNA重復(fù)序列和與之相結(jié)合的蛋白質(zhì)分子構(gòu)成的。 在大多數(shù)生物中，端粒DNA只是由幾個(gè)堿基組成的DNA重復(fù)單位通過串聯(lián)重復(fù)而形成，長(zhǎng)度從20bp到幾個(gè)kb不等。 釀酒酵母端粒DNA的長(zhǎng)度約為300bp，其DNA重復(fù)單位為： 5′C1-3A 3′G1-3T,,在大多數(shù)生物中，端粒DNA的旁邊

7、還常含有由中等重復(fù)序列組成的DNA。在酵母中，與端粒相連的DNA有兩類：,,X 保守性較差，長(zhǎng)度為0.3~3.7kb，存在于大多數(shù)染色體上。,Y' 高度保守，長(zhǎng)度為6.7kb,釀酒酵母中2/3的端粒含有1~4個(gè)拷貝的Y'。,X和Y'作用：非必需，對(duì)端粒的穩(wěn)定、染色體斷裂后的修復(fù)以及在減數(shù)分裂中染色體聯(lián)會(huì)方面都起輔助作用。,,3.復(fù)制起點(diǎn) 酵母的復(fù)制起點(diǎn)是指染色體上控制DNA復(fù)制起始的一小

8、段DNA序列，通常稱為自主復(fù)制序列(autonomously replicatory sequence，ARS)。 自1979年首次發(fā)現(xiàn)釀酒酵母的ARS以來，已在釀酒酵母中約有400個(gè)ARS， ARS/40kb。但這些ARS的使用頻率不同，變動(dòng)在0-100%之間。,（1） 自主復(fù)制序列ARS的結(jié)構(gòu)釀酒酵母中，ARS是長(zhǎng)度為100~200bp、富含 A T 的DNA片段。根據(jù)其在質(zhì)粒中的穩(wěn)定性，可分為三個(gè)結(jié)構(gòu)域：其中A和

9、B最為重要,（2）ARS-結(jié)合蛋白釀酒酵母復(fù)制的起始可能是通過蛋白質(zhì)與ARS相互作用而引起的 。與ARS結(jié)合的蛋白有六種，分子質(zhì)量分別：120kD、72kD、62kD、57kD、53kD和50KD,這些蛋白以復(fù)合物的形式存在并與ACS結(jié)合，這種蛋白質(zhì)復(fù)合體稱為起始識(shí)別復(fù)合物（ORC）。ORC與A區(qū)結(jié)合，也與B區(qū)結(jié)合。另外，Abflp也是一種主要的ARS結(jié)合的蛋白，能提高復(fù)制效率。,,（3） ARS啟動(dòng)染色體復(fù)制的活性釀酒酵母基因

10、組中約有400個(gè)ARS，但并不是所有的ARS在原染色體上都具有自主復(fù)制活性。可是，將這些染色體上的ARS克隆到質(zhì)粒上后，卻都有自主復(fù)制活性。從使用的時(shí)序來看，可分為兩類：位于不同位點(diǎn)表現(xiàn)的活性不同，靠近端粒的ARS，一般不表現(xiàn)活性。,第二節(jié) 酵母線粒體基因組及其遺傳,線粒體是真核細(xì)胞重要的代謝中心之一。線粒體DNA(mtDNA)編碼線粒體自身所需的rRNA、tRNA以及某些蛋白質(zhì)如細(xì)胞色素和ATP酶等。 （一）呼吸缺陷突變株

11、酵母可以通過呼吸和發(fā)酵這兩種代謝形式來取得能量，在有氧條件下呼吸，缺氧條件下發(fā)酵。小菌落突變株：吖啶黃處理野生酵母后，出現(xiàn)很多在好氣條件下生長(zhǎng)緩慢的突變株。（缺少細(xì)胞色素a、b以及細(xì)胞色素c氧化酶） 分離性小菌落：染色體上基因發(fā)生了突變 類型 中性小菌落：完全丟失了線粒體DNA 抑制性小菌落：丟失了部分線粒體DNA,,（二）酵

12、母線粒體基因組的物理圖譜及其特點(diǎn),1.酵母線粒體DNA是周長(zhǎng)約26μm的環(huán)狀DNA分子，其大小為84kb。2.絕大多數(shù)的mtDNA中沒有重復(fù)核苷酸序列。3.線粒體是半自主性的，能復(fù)制并傳遞給后代，還能轉(zhuǎn)錄所編碼的遺傳信息，合成線粒體某些自身特有的多肽，但是并非自給自足。,第三節(jié) 酵母菌中的質(zhì)粒,（一）2μm質(zhì)粒 環(huán)狀且周長(zhǎng)為2μm的DNA雙鏈、50－100個(gè)拷貝，只攜帶與復(fù)制和重組有關(guān)的4個(gè)蛋白質(zhì)基因（REP1、REP2、REP

13、3和FLP），不賦予宿主細(xì)胞遺傳表型，屬于隱蔽質(zhì)粒。,1.特征：質(zhì)粒上有兩個(gè)600bp長(zhǎng)的反向重復(fù)序列（IR），這兩個(gè)IR中間由一個(gè)大單一區(qū)域和小單一區(qū)域所間隔。2.在兩個(gè)IR上各有一個(gè)FRT(專一性重組位點(diǎn))，由于這兩個(gè)FRT間的相互重組，產(chǎn)生A型和B型兩種互變異構(gòu)型的混合質(zhì)粒。,（二） 嗜殺現(xiàn)象,1963年，Bevan和Makower發(fā)現(xiàn)釀酒酵母中某些菌株可產(chǎn)生毒素而殺死其他酵母的現(xiàn)象。 嗜殺株（killer）：產(chǎn)生毒素的

14、菌株 敏感株：對(duì)毒素敏感的菌株 中性株：既不產(chǎn)毒素又不敏感的菌株 該特性由兩種具有自我復(fù)制能力的細(xì)胞遺傳因子----雙鏈線狀RNA(dsRNA)決定的，它們通常以蛋白質(zhì)外殼包裹著的粒子狀態(tài)存在于細(xì)胞之中，不具有體外侵染的特性。也稱為類病毒顆粒（virus-like particle）. 分類：L型類病毒、M型類病毒 L-dsRNA:編碼自身和M型的蛋白外殼和RNA聚合酶

15、 M-dsRNA：編碼殺傷毒素蛋白，分泌到細(xì)胞外。,第四節(jié) 酵母基因表達(dá)的調(diào)控,根據(jù)其性質(zhì)，真核基因調(diào)控分兩類:1、瞬間調(diào)控（可逆性控制）2、發(fā)育調(diào)控（不可逆性控制）,上游激活序列（upstream activating sequence UAS）TATA元件轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)沉默子,一、酵母基因的啟動(dòng)元件（順式作用元件）,二、酵母轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子（反式作用蛋白）,通用轉(zhuǎn)錄因子 結(jié)合在TATA序列附近，包括TFII-

16、A、TFII-B、TGII-D、TFII-E、TFII-F等。轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子（結(jié)合在啟動(dòng)子上游） 轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白由兩個(gè)獨(dú)立的結(jié)構(gòu)域組成：（1）DNA結(jié)合區(qū)（2）轉(zhuǎn)錄激活區(qū),1.TATA 區(qū)結(jié)合蛋白,轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物由 TATA 元件附近序列及轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)等順式作用元件和多種通用轉(zhuǎn)錄因子及RNA聚合酶Ⅱ組成。 成環(huán)假說,2.GAL4轉(zhuǎn)錄因子和gal基因的表達(dá)調(diào)控,酵母半乳糖代謝酶基因（gal）表達(dá)可以被生長(zhǎng)條件所控制。半

17、乳糖通過轉(zhuǎn)化為6-磷酸葡萄糖后進(jìn)入糖酵解途徑而被酵母利用。 gal基因的轉(zhuǎn)錄是被嚴(yán)格調(diào)控的。gal1基因、gal7基因、gal10基因和gal12基因在沒有半乳糖的條件下不表達(dá)，而在半乳糖存在條件下表達(dá)水平提高約1000 倍。,3.GCN4轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子 GCN4能特異結(jié)合到許多氨基酸合成酶基因的啟動(dòng)子調(diào)控元件上，激活基因的轉(zhuǎn)錄。,HAP1 HAP2和HAP3都是轉(zhuǎn)錄因子，控制酵母細(xì)胞色素c基因CYC1和CYC7的轉(zhuǎn)錄。

18、CYC1 UAS 由 UAS1 和UAS2 兩個(gè)位點(diǎn)組成。 UAS1 與葡萄糖抑制時(shí)基因的轉(zhuǎn)錄有關(guān) UAS1和UAS2共同作用 是乳糖去阻遏時(shí)基因轉(zhuǎn)錄所必需的。,4.HAP1 HAP2和HAP3,酵母細(xì)胞的單倍體類型是由接合型基因（MATα和MATa）決定的。MATα編碼α1和α2兩個(gè)蛋白調(diào)控因子，它們決定α型細(xì)胞的表型。MATa編碼a1蛋白，控制a型細(xì)胞的表型。,5.α1、α2和a1調(diào)節(jié)蛋白,一、釀酒酵母的生活史二、釀酒

19、酵母細(xì)胞分裂的遺傳控制 1、a和α單倍體細(xì)胞 2、接合信息素信號(hào)的傳遞 3、接合型基因MAT在接合過程中的調(diào)控作用三、接合型基因的轉(zhuǎn)換 1、酵母接合型基因的結(jié)構(gòu) 2、接合型轉(zhuǎn)換機(jī)理,第五節(jié) 接合型基因及其基因型轉(zhuǎn)換,第五節(jié) 接合型基因及其基因型轉(zhuǎn)換,一、釀酒酵母的生活史,一、釀酒酵母的生活史二、釀酒酵母細(xì)胞分裂的遺傳控制 1、a和α單倍體

20、細(xì)胞 2、接合信息素信號(hào)的傳遞 3、接合型基因MAT在接合過程中的調(diào)控作用三、接合型基因的轉(zhuǎn)換 1、酵母接合型基因的結(jié)構(gòu) 2、接合型轉(zhuǎn)換機(jī)理,第五節(jié) 接合型基因及其基因型轉(zhuǎn)換,第五節(jié) 接合型基因及其基因型轉(zhuǎn)換,二、釀酒酵母細(xì)胞分裂的遺傳控制,酵母的有性生殖取決于兩個(gè)單倍體細(xì)胞的接合型，其接合型的“性別” 是由其本身的遺傳物質(zhì)所決定的，是穩(wěn)定的遺傳特征。,1、a和α單倍體細(xì)

21、胞,第五節(jié) 接合型基因及其基因型轉(zhuǎn)換,二、釀酒酵母細(xì)胞分裂的遺傳控制,α細(xì)胞分泌的α-因子與a細(xì)胞中ste2基因編碼的受體蛋白結(jié)合。同樣，a細(xì)胞分泌的a-因子與α細(xì)胞中ste3基因編碼的受體蛋白結(jié)合。,2、接合信息素的傳遞,第五節(jié) 接合型基因及其基因型轉(zhuǎn)換,二、釀酒酵母細(xì)胞分裂的遺傳控制,2、接合信息素的傳遞,第五節(jié) 接合型基因及其基因型轉(zhuǎn)換,二、釀酒酵母細(xì)胞分裂的遺傳控制,2、接合信息素的傳遞,在釀酒酵母中，磷酸化的轉(zhuǎn)錄因子Ste12

22、是一個(gè)控制不同發(fā)育過程起始的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子。 在單倍體細(xì)胞中，Ste12通過阻遏單倍體細(xì)胞特異性基因的表達(dá)和促進(jìn)與接合有關(guān)的必需基因的表達(dá)，從而促進(jìn)接合所需的生理反應(yīng)，最終形成合子； 在雙倍體細(xì)胞中，Ste12是細(xì)胞生長(zhǎng)所必需的。,第五節(jié) 接合型基因及其基因型轉(zhuǎn)換,二、釀酒酵母細(xì)胞分裂的遺傳控制,3、接合型基因MAT在接合過程中的調(diào)控作用,釀酒酵母的單倍體細(xì)胞a和α兩種接合型, 分別是由MATa和MATα基因決定的。

23、 MATα編碼α1和α2兩種調(diào)節(jié)蛋白。α1蛋白激活αsg基因群的表達(dá)，而α2是一種同源結(jié)構(gòu)域蛋白, 阻遏性地抑制asg基因群的表達(dá)，因此, 在MATα細(xì)胞中表現(xiàn)出α型細(xì)胞的表型性狀。 MATa也編碼a1和a2兩種蛋白，但a2蛋白的功能不清楚，與接合作用的調(diào)控?zé)o關(guān)；a1蛋白在單倍體細(xì)胞中不起作用，只在二倍體細(xì)胞中起作用。在a型細(xì)胞中,asg基因群可組成型地表達(dá), 表現(xiàn)出a型細(xì)胞的表型性狀。,第五節(jié) 接合型基因及其基因型轉(zhuǎn)換,

24、二、釀酒酵母細(xì)胞分裂的遺傳控制,3、接合型基因MAT在接合過程中的調(diào)控作用,（1）當(dāng)a和α細(xì)胞接合形成a/α二倍體細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)的接合型基因以MATa/MATα二倍體的形式存在。 (2)MATα生成的α2蛋白抑制asg基因群的表達(dá)，同時(shí)α2和a1蛋白協(xié)同作用阻礙α1和所有hsg基因群的表達(dá)。 (3)因此細(xì)胞不再具備接合能力, 而是激活二倍體特異性基因的轉(zhuǎn)錄, 同時(shí)信息素的信號(hào)系統(tǒng)也終止。 (4)二倍體細(xì)

25、胞在營(yíng)養(yǎng)條件不良時(shí),進(jìn)行減數(shù)分裂以產(chǎn)生子囊孢子。,第五節(jié) 接合型基因及其基因型轉(zhuǎn)換,三、接合型基因的轉(zhuǎn)換,1、酵母接合型基因的結(jié)構(gòu),a可以轉(zhuǎn)變成α型, α型也可以轉(zhuǎn)變成a型。這兩者可以相互轉(zhuǎn)變的現(xiàn)象稱為接合型轉(zhuǎn)變(mating type conversion)。 這些品系帶有顯性等位基因 HO 并頻繁地改變它們的交配型（常常每代改變一次），帶有隱性等位基因 ho 的品系有一個(gè)穩(wěn)定的交配型，其交配型改變的頻率僅約 10 -6 。

26、 接合型轉(zhuǎn)換的存在表明所有的細(xì)胞都含有稱為MATa和MATα所需要的信息，但是只有類型獲得表達(dá)。,第五節(jié) 接合型基因及其基因型轉(zhuǎn)換,三、接合型基因的轉(zhuǎn)換,1、酵母接合型基因的結(jié)構(gòu),為什么會(huì)出現(xiàn)接合型的轉(zhuǎn)變呢？ 接合型基因MAT的兩側(cè)有兩個(gè)沉默基因座位HMLα和HMLa，它們與MAT位于同一染色體上，與MAT的距離分別是180kb和150kb。HML和HMR含有與MAT相同的交配型基因，但只有MAT座位的基因才組成型的表達(dá)

27、，而HMLα和HMRa不表達(dá)。,第五節(jié) 接合型基因及其基因型轉(zhuǎn)換,三、接合型基因的轉(zhuǎn)換,1、酵母接合型基因的結(jié)構(gòu),1.在兩個(gè)沉默基因座位HML和HMR的兩側(cè)各有抑制表達(dá)的沉默子，位于HML上游的沉默子（EL）和下游的沉默子（IL），位于HMR上游的沉默子（ER）和下游的沉默子（IR）。沉默子對(duì)基因的表達(dá)起負(fù)調(diào)控作用，即抑制基因的表達(dá)。 2.SIR1、SIR2、SIR3、SIR4這幾種蛋白通過與E位點(diǎn)的相互作用而抑制基因的轉(zhuǎn)錄。

28、E的行為類似于負(fù)增強(qiáng)子，可在離啟動(dòng)子2.5kb遠(yuǎn)距離行使功能，且無方向性?；钴S基因上無E位點(diǎn)和I位點(diǎn)。,第五節(jié) 接合型基因及其基因型轉(zhuǎn)換,三、接合型基因的轉(zhuǎn)換,2、接合型轉(zhuǎn)換機(jī)理,接合型的轉(zhuǎn)換說明發(fā)生了基因轉(zhuǎn)變，這種轉(zhuǎn)變是由于受體位點(diǎn)MAT的Yα或Ya被位于同一染色體上的HMRα中的Ya或HMLα中的Yα序列所取代而完成的。 這種基因轉(zhuǎn)換是由HO內(nèi)切酶所引起的。HO內(nèi)切酶只對(duì)MAT的Y區(qū)右側(cè)的Y-Z交界處進(jìn)行識(shí)別和切割，HO內(nèi)

29、切酶引起的雙鏈斷裂，激發(fā)了MAT序列的轉(zhuǎn)換過程，這種轉(zhuǎn)換實(shí)際上是一種重組過程。,第六節(jié) 酵母的載體系統(tǒng),根據(jù)其功能可分為三大類： 克隆載體 表達(dá)載體 分泌載體轉(zhuǎn)化方法：電轉(zhuǎn)化法 醋酸鋰法,一、克隆載體,1、酵母整合型載體（YIp) 2、酵母附加體質(zhì)粒載體（YEp） 3、酵母菌復(fù)制載

30、體（YRp) 4、酵母著絲粒載體（YCp) 5、酵母人工染色體（YAC),1．酵母整合型載體（YIp）,1. 這類載體只含有大腸桿菌的復(fù)制起點(diǎn), 不能在酵母菌中自主復(fù)制。但可以與酵母染色體進(jìn)行同源重組, 以低頻率整合到酵母細(xì)胞染色體上。 2. 整合位點(diǎn)數(shù)取決于載體中的互補(bǔ)基因序列數(shù)。通常以單拷貝存在, 少數(shù)發(fā)生多位點(diǎn)整合。 3. 大部分YIp質(zhì)粒含酵母菌選擇標(biāo)記(如HIS3、LEU2、URA3等

31、)。 4.這種質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子很穩(wěn)定,可在無選擇條件下培養(yǎng)很多代而不丟失,但其轉(zhuǎn)化率很低,2．酵母附加體質(zhì)粒載體（YEp）,載體的拷貝數(shù)多（50~100）、穩(wěn)定性好，是酵母遺傳工程中應(yīng)用最廣泛的載體系統(tǒng)，常用于酵母菌中的一般基因克隆和基因表達(dá)的研究。,3．酵母菌復(fù)制載體(YRp),Yrp含有酵母自主復(fù)制序列（ARS），可作為染色體外因子復(fù)制并保留下來。這類載體轉(zhuǎn)化率高，拷貝數(shù)也高，但在減數(shù)分裂和有絲分裂中不穩(wěn)定而使群體內(nèi)的拷貝數(shù)變化

32、很大。,4．酵母著絲粒載體(YCp),1.含有酵母染色體的著絲粒（CEN），在細(xì)胞分裂時(shí)新復(fù)制的質(zhì)粒均等分離，每一個(gè)細(xì)胞得到1~3個(gè)質(zhì)粒，故拷貝數(shù)很低，但很穩(wěn)定。2.由于YCp的高穩(wěn)定性和低拷貝數(shù)，因此這類質(zhì)粒適合做亞克隆載體和構(gòu)建酵母基因組DNA文庫3.還可用于檢測(cè)有絲分裂中染色體倍性變化和分析鑒定酵母基因突變等研究。,YAC載體的使用：,一些哺乳動(dòng)物的基因大于100kb超過了大腸桿菌載體系統(tǒng)的承受范圍，但正好在YAC載體的范圍之

33、內(nèi)。研究發(fā)現(xiàn)，在某些情況下，YACs可以在哺乳動(dòng)物中表達(dá)，因此可以在基因存在的生物中研究基因的功能。　　YACs在構(gòu)建基因文庫中非常重要，最高容量的大腸桿菌質(zhì)?？梢圆迦?00kb的片斷，對(duì)于人的基因文庫需要30000個(gè)克隆，而YACs可以克隆600kb的片段，一些類型可以攜帶1400kb片段，可以使人類基因文庫的克隆數(shù)降至6500個(gè)。雖然，”mega-YACs”存在著不穩(wěn)定性，克隆的DNA片段可以被重新排列。但是，YACs在大規(guī)模的測(cè)

34、序中是非常有用的。,YAC(yeast artificial chromosome)是人工構(gòu)建的具有酵母染色體功能的人工染色體載體。1983年Murray等人將酵母的著絲粒、自主復(fù)制序列及一些標(biāo)記基因與四膜蟲大核 rDNA末端的端粒連接在一起，共同構(gòu)成了長(zhǎng)度為55kb的酵母人工染色體。1987年，美國(guó)華盛頓大學(xué)的Burke等人構(gòu)建了能克隆大片段的酵母人工染色體，這是真正意義上的第一代 YAC載體系統(tǒng)。,5．酵母的人工染色體(YA

35、C),酵母的表達(dá)載體包括酵母菌的強(qiáng)啟動(dòng)子、多克隆位點(diǎn)、終止子。外源結(jié)構(gòu)基因插入多克隆位點(diǎn)的適當(dāng)酶切位點(diǎn)，在強(qiáng)啟動(dòng)子的調(diào)節(jié)下，外源基因就可進(jìn)行高效表達(dá)。 酵母啟動(dòng)子分兩大類：第一類是來自編碼解糖酶基因的解糖啟動(dòng)子，如ADHI、PGK、GAP、ENOI等，這些啟動(dòng)子能在酵母菌中高水平組成型表達(dá)；第二類是強(qiáng)調(diào)節(jié)啟動(dòng)子，其中GAL1、GAL7和GAL10是半乳糖調(diào)節(jié)啟動(dòng)子。。,二、酵母菌的表達(dá)載體(YXp),分泌載體是一種將基

36、因產(chǎn)物分泌到胞外的一類載體。 酵母菌的分泌載體除必須含有表達(dá)載體的啟動(dòng)子和終止子外，還需要在表達(dá)載體的起始密碼子(ATG)的上游有分泌信號(hào)序列。,三、酵母菌的分泌載體(YSp),第七節(jié) 酵母雙雜交系統(tǒng),1.作用：酵母雙雜交系統(tǒng)是研究酵母體內(nèi)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的一種方法。2.原理：gal4基因編碼的GAL4是酵母半乳糖代謝酶基因（gal）轉(zhuǎn)錄必需的轉(zhuǎn)錄激活蛋白質(zhì)。GAL4包含兩個(gè)可分割的、功能相互獨(dú)立的結(jié)構(gòu)域(1)D

37、NA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(DNA-BD):：能識(shí)別和結(jié)合到啟動(dòng)子的上游激活序列；(2)轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(DNA-AD) ：通過同RNA聚合酶相互作用，啟動(dòng)UAS下游的基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。 這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域分開時(shí)仍各自具有功能，但不能激活轉(zhuǎn)錄，只有當(dāng)被分開的兩者通過適當(dāng)?shù)耐緩皆诳臻g上較為接近時(shí)，才能重新呈現(xiàn)完整的轉(zhuǎn)錄因子活性。,（一） 酵母雙雜交系統(tǒng)原理,在酵母雙雜交系統(tǒng)中，將兩個(gè)待測(cè)蛋白X和Y分別于DNA-BD結(jié)構(gòu)域和DNA-AD結(jié)構(gòu)域融合。

38、 1.如果 X和Y沒有相互作用，不能激活UAS下游報(bào)告基因的表達(dá)。 2.如果X和Y存在相互作用，可激活UAS下游報(bào)告基因的表達(dá)。,（一） 酵母雙雜交系統(tǒng)原理,用酵母雙雜交系統(tǒng)研究?jī)蓚€(gè)蛋白質(zhì)之間的相互作用時(shí)，首先將X和Y的基因分別克隆到AD和BD兩個(gè)質(zhì)粒載體中，構(gòu)建兩個(gè)重組質(zhì)粒，然后將兩個(gè)重組質(zhì)粒共同導(dǎo)入酵母細(xì)胞中，從而實(shí)現(xiàn)在同一個(gè)酵母細(xì)胞中同時(shí)表達(dá)兩個(gè)融合蛋白。 因此，完整的酵母雙雜交系統(tǒng)由三部分組成：AD載體、BD載

39、體和帶有報(bào)告基因的酵母菌株。,將AD結(jié)構(gòu)域克隆到另一個(gè)酵母表達(dá)載體上，構(gòu)建成和 pGAD-C（X）質(zhì)粒, 稱為目標(biāo)質(zhì)粒（Pray plasmid）,將BD結(jié)構(gòu)域克隆一個(gè)酵母表達(dá)載體上，構(gòu)建成pGBD-C(X)質(zhì)粒，稱為誘餌質(zhì)粒（Bait plasmid）,,SC-Try-Lue-His- X-gal,,,,,,,,,,,能生長(zhǎng)，且為蘭色菌落,1.酵母PJ69-4A菌株本身無報(bào)告基因轉(zhuǎn)錄活性。2.這些啟動(dòng)子都受完整GAL4蛋白的誘導(dǎo)后

40、可以高效表達(dá)。另外，該菌中的gal4基因被缺失，這樣報(bào)告基因的表達(dá)完全依賴于表達(dá)載體所提供的GAL4 AD 結(jié)構(gòu)域和BD 結(jié)構(gòu)域在空間的互相靠近。,,,不能生長(zhǎng)，即使生長(zhǎng)也是白色菌落,SC-Try-Lue-His- X-gal,,,,,,1. 有很高的靈敏性，可以檢測(cè)到生物化學(xué)方法檢測(cè)不到的相較弱及暫時(shí)的蛋白質(zhì)間的相互作用。2.  酵母雙雜交系統(tǒng)是直接在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)融合蛋白，減少了人工純化蛋白質(zhì)的繁瑣步驟。3.&

41、#160; 酵母雙雜交系統(tǒng)是在活細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行，蛋白質(zhì)相對(duì)于體外更可能處于天然狀態(tài)，因此更能代表細(xì)胞內(nèi)的真實(shí)情況。4.  融合載體可以進(jìn)行各種修飾以利于后續(xù)工作中確認(rèn)蛋白質(zhì)間的相互作用。如BD和AD載體各自帶上不同的表面抗原標(biāo)記以方便地用這些抗原的抗體來鑒定蛋白質(zhì)。,二、酵母雙雜交系統(tǒng)的特點(diǎn),三、 酵母雙雜交系統(tǒng)的應(yīng)用,酵母雙雜交系統(tǒng)主要用在兩個(gè)方面：①研究?jī)蓚€(gè)蛋白質(zhì)之間的相互作用；②篩選與已知蛋白質(zhì)