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文檔簡介
1、背景:
帕金森病(Parkinson’s disease,PD)是全球第二大神經退行性疾病,在60歲以上老人中,其發(fā)病率達到了1%,該病不僅嚴重影響了病人的身心健康,而且給家庭及社會都會造成巨大的負擔。PD表現為慢性進展病程,臨床表現多樣,其中靜止性震顫是PD的典型表現。PD的病理表現主要是中腦黑質致密部(Substantia nigra pars compacta,SNc)多巴胺能神經元缺失,從而引起紋狀體內多巴胺含量顯著減
2、少,最終導致發(fā)病。
小膠質細胞是中樞神經系統內的免疫固有細胞,其在監(jiān)視大腦內損傷及病原體侵入方面發(fā)揮重要的免疫學作用,同時在維護神經元微環(huán)境穩(wěn)定中發(fā)揮重要的調節(jié)作用。小膠質細胞在中腦SNc區(qū)密度明顯高于其他腦區(qū),細胞動物實驗以及PD病人尸檢腦片均已證明了小膠質細胞在PD發(fā)病過程中起了重要作用,因此小膠質細胞介導的神經系統炎癥反應被認為是多巴胺能神經元的丟失、PD發(fā)病的重要原因之一。
肌細胞增強因子(Myocyte e
3、nhancer factor,MEF2)作為機體內重要的轉錄因子,其廣泛表達于各種細胞,如骨骼肌細胞、心肌細胞,免疫細胞及神經元等,通過調節(jié)多種基因的轉錄而發(fā)揮重要的作用。近年來,不斷的研究表明,MEF2在PD病人中,對于多巴胺能神經元的保護具有重要作用。此外,已有研究顯示在外周T細胞中可以檢測到MEF2D表達,并且MEF2D參與炎癥反應的調節(jié)過程。但是,對于MEF2D在小膠質細胞中是否表達,以及其在小膠質細胞中的主要作用的研究,目前國
4、內外還沒有這方面的報道。
目的:
本實驗主要研究轉錄因子MEF2D在腦內的小膠質細胞內的表達情況、MEF2D轉錄調控的下游靶基因,以及在小膠質細胞活化時,MEF2D在炎癥反應中的調節(jié)作用與相關機制及其對多巴胺能神經元存活的影響。
方法:
首先,觀察活化的小膠質細胞內MEF2D的表達水平。通過腹腔注射MPTP,建立C57小鼠急性PD模型,制作SNc區(qū)腦組織切片,使用免疫熒光染色觀察小膠質細胞內的ME
5、F2D水平。使用脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)刺激BV2細胞系及原代培養(yǎng)的膠質細胞,通過qPCR及免疫印跡檢測技術,觀察不同時間點下MEF2D的mRNA水平及蛋白水平表達情況,然后利用EMSA方法檢測MEF2D的活性變化。
其次,探索LPS刺激條件下BV2細胞系內MEF2D的功能作用。通過qPCR及ELISA實驗方法檢測LPS刺激條件下BV2內的炎癥因子TNF-α的表達水平及抗炎因子IL-10的表達水平
6、。通過ChIP技術檢測MEF2D與IL-10基因啟動子區(qū)結合的情況。利用含有能特異性干擾MEF2D的shRNA的重組慢病毒感染BV2,檢測LPS刺激BV2細胞條件下,細胞內IL-10及TNF-α的表達情況。利用BV2細胞的培養(yǎng)上清建立小膠質細胞與神經元的共培養(yǎng)模型,通過MTT及TUNEL實驗檢測不同實驗條件下,共培養(yǎng)中的神經元存活情況。
結果:
實驗一:中腦黑質區(qū)活化的小膠質細胞內MEF2D的表達變化。
通
7、過建立急性PD模型,可以看到受到刺激后活化的小膠質細胞內MEF2D表達水平明顯升高,同時SNc區(qū)多巴胺能神經元死亡增加。使用LPS刺激BV2細胞及原代培養(yǎng)的膠質細胞,可以看到,在受到LPS刺激24小時后,原代細胞內的MEF2D表達水平明顯升高,而在BV2細胞內,LPS刺激18小時后MEF2D的mRNA水平及蛋白水平均開始升高。使用EMSA技術可以檢測到LPS刺激24小時后,BV2內的MEF2D蛋白活性水平也是升高的。
實驗二:
8、活化的小膠質細胞內MEF2D調控的靶基因的研究。
檢測LPS刺激條件下,BV2的TNF-α及IL-10的表達,可以看到TNF-α表達水平在2小時達到最高,而IL-10的表達從刺激后18小時開始升高,且其升高趨勢和MEF2D的變化是相符合的。ChIP實驗顯示,IL-10是MEF2D調節(jié)的下游因子。使用慢病毒干擾BV2內MEF2D的表達,免疫印跡實驗檢測干擾效率符合實驗要求。干擾MEF2D后,LPS刺激后BV2內IL-10的表達水
9、平及分泌水平均顯著降低,而TNF-α的mRNA表達水平明顯升高。
實驗三:活化的小膠質細胞內MEF2D對于多巴胺能神經元存活的影響
用培養(yǎng)BV2細胞的上清液培養(yǎng)多巴胺能神經元細胞系SN4741細胞,建立共培養(yǎng)模型。干擾BV2細胞內MEF2D的表達或者利用IL-10中和抗體阻斷IL-10的功能,均能夠提高LPS刺激后BV2細胞培養(yǎng)上清液的神經元毒性,誘導更多的神經元凋亡。
結論:
我們的研究首次揭示
10、了MEF2D在小膠質細胞內表達,其表達水平在小膠質細胞活化后明顯升高,升高的MEF2D同時伴隨著神經炎癥因子的表達降低及抗炎因子的表達升高,通過分子生物學及細胞生物學方法我們發(fā)現MEF2D直接調控了抗炎因子IL-10的表達。從而闡明了一個全新的小膠質細胞活化后炎癥的發(fā)生發(fā)展的調節(jié)過程:小膠質細胞活化引起了MEF2D水平的升高,MEF2D調節(jié)IL-10基因的轉錄過程,從而使其表達及分泌增多,升高的抑炎因子抑制了小膠質細胞分泌炎性因子,明確
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