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文檔簡(jiǎn)介
1、本研究利用實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎模型,觀察不同神經(jīng)功能評(píng)分EAE的病理學(xué)變化,并檢測(cè)中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞的活化及CD4+T細(xì)胞的變化,觀察二者的相互作用,試圖探討小膠質(zhì)細(xì)胞在MS/EAE發(fā)病和緩解中的作用。應(yīng)用熒光定量PCR觀察CD4+T細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞在mRNA水平上的變化,同時(shí)觀察腦組織內(nèi)細(xì)胞因子IFN-γ、IL-17、IL-10的變化,探討這些細(xì)胞因子在EAE發(fā)病過(guò)程中的作用。為此,我們用MOG35-55抗原輔以完全弗氏佐劑
2、免疫C57BL/6小鼠,通過(guò)對(duì)小鼠體重、癥狀及中樞神經(jīng)系統(tǒng)病理改變的觀察,評(píng)估EAE模型的建立情況,采用國(guó)際公認(rèn)的神經(jīng)功能評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)對(duì)發(fā)病小鼠的臨床癥狀進(jìn)行評(píng)分。同時(shí)利用病理學(xué)染色觀察EAE小鼠不同時(shí)期的病理學(xué)改變,用HE染色、Luxol Fast Blue髓鞘染色和Bielschowsky銀染分別評(píng)估炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、髓鞘脫失和軸索損傷情況。利用免疫組織化學(xué)染色法對(duì)CD4+T細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記,觀察兩種細(xì)胞的變化及二者之間是否存在相互
3、作用。應(yīng)用熒光定量PCR技術(shù)驗(yàn)證二者在mRNA水平上的變化。用半定量PCR和熒光定量PCR檢測(cè)不同病程分期EAE小鼠腦組織中細(xì)胞因子干擾素-gamma(Interferon-γ,IFN-γ),白細(xì)胞介素-17(Interleukin-17,IL-17)及IL-10mRNA的表達(dá)情況。通過(guò)不同分值EAE模型與對(duì)照組的比較,從病理學(xué)、免疫學(xué)和分子學(xué)水平動(dòng)態(tài)的觀察EAE模型的變化,進(jìn)一步闡明EAE及MS發(fā)病機(jī)制,為研發(fā)MS新的治療手段提供實(shí)驗(yàn)
4、依據(jù)。
本實(shí)驗(yàn)成功建立的EAE模型,小鼠發(fā)病率為85%,最高臨床癥狀的神經(jīng)功能評(píng)分可達(dá)4.0分。小鼠臨床癥狀最早出現(xiàn)于免疫后第13天,大部分以體重減輕和尾部張力下降為首發(fā)癥狀,隨繼出現(xiàn)尾巴無(wú)力癱瘓、拖行、步態(tài)蹣跚及雙后肢無(wú)力癱瘓等神經(jīng)系統(tǒng)癥狀,有些小鼠進(jìn)展為四肢癱瘓,甚至死亡。平均發(fā)病時(shí)間為(15.3±2.1)天,平均臨床分值為2.59±0.65分。對(duì)照組小鼠均未出現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)癥狀,體重持續(xù)增加。病理學(xué)改變是:脊髓HE染色顯示,
5、在疾病誘導(dǎo)期脊髓實(shí)質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)炎性細(xì)胞,但數(shù)量不多。隨著疾病的進(jìn)展,炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)越來(lái)越多,在血管周圍可見到典型的血管“袖套樣”改變,在疾病恢復(fù)期,浸潤(rùn)的炎性細(xì)胞逐漸減少??梢姷侥z質(zhì)細(xì)胞增生,形成膠質(zhì)結(jié)節(jié),在疾病高峰期還可見到明顯的衛(wèi)星現(xiàn)象及噬神經(jīng)現(xiàn)象。髓鞘染色可見大小不等的片狀脫髓鞘區(qū),呈空泡樣變;在疾病恢復(fù)期,脫髓鞘區(qū)域內(nèi)有髓鞘重建。Bielschowsky銀染顯示大量軸索腫脹、變形、斷裂,形成軸索卵圓體。免疫學(xué)染色見隨著EAE疾病的進(jìn)
6、展和恢復(fù),CD4+T細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量呈現(xiàn)明顯的動(dòng)態(tài)改變,隨著疾病的進(jìn)展,數(shù)量增加,在疾病高峰期達(dá)到最大值,恢復(fù)期數(shù)量有所減少。小膠質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)也呈動(dòng)態(tài)改變,由靜息狀態(tài)下的細(xì)小分枝狀分化為粗短分枝狀的反應(yīng)性小膠質(zhì)細(xì)胞,在疾病高峰期呈阿米巴樣或橢圓狀,恢復(fù)期逐漸恢復(fù)至細(xì)小分枝狀,小膠質(zhì)細(xì)胞與CD4+T細(xì)胞之間的動(dòng)態(tài)改變有一定的關(guān)聯(lián)性,推測(cè)二者之間存在相互作用。從mRNA水平上驗(yàn)證了CD4+T細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞的動(dòng)態(tài)變化。半定量PCR和熒光
7、定量PCR檢測(cè)出腦組織內(nèi)炎性因子IFN-γ、IL-17和IL-10 mRNA表達(dá)的變化,結(jié)果顯示,IFN-γ、IL-17和IL-10 mRNA的表達(dá)呈單峰狀曲線,與疾病進(jìn)展密切相關(guān)。
通過(guò)以上研究得到以下結(jié)論:
1.隨著EAE疾病的進(jìn)展,小膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)生活化,數(shù)量和形態(tài)均呈動(dòng)態(tài)改變,表明小膠質(zhì)細(xì)胞在EAE的發(fā)生發(fā)展中的功能也發(fā)生改變,對(duì)疾病的進(jìn)展和恢復(fù)具有重要作用。
2. CD4+T細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞之間存在相
8、互作用。
神經(jīng)性炎癥是MS/EAE的病理特征,特點(diǎn)是激活的小膠質(zhì)細(xì)胞和浸潤(rùn)的T細(xì)胞共同導(dǎo)致神經(jīng)元損傷。作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)的免疫細(xì)胞,小膠質(zhì)細(xì)胞的活化被認(rèn)為是中樞神經(jīng)系統(tǒng)微環(huán)境變化最敏感的標(biāo)志,但小膠質(zhì)細(xì)胞的作用是雙向的,既可以通過(guò)吞噬組織中的病原體及有害顆粒對(duì)神經(jīng)元起保護(hù)作用,也可以在致炎因子的作用下激活成反應(yīng)性小膠質(zhì)細(xì)胞,分泌炎性細(xì)胞因子對(duì)神經(jīng)元起毒性作用。在EAE中,小膠質(zhì)細(xì)胞的激活是疾病發(fā)生和發(fā)展過(guò)程的重要參與者,目前對(duì)小
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