小膠質(zhì)細(xì)胞活化抑制對(duì)慢性EAE中軸索損傷的保護(hù)作用及米諾環(huán)素的影響.pdf

1、研究目的： 本研究利用慢性非緩解型小鼠實(shí)驗(yàn)性變態(tài)反應(yīng)性腦脊髓炎（EAE）模型和小膠質(zhì)細(xì)胞體外培養(yǎng)模型，探討小膠質(zhì)細(xì)胞活化在慢性EAE軸索損傷中的作用機(jī)制，以及米諾環(huán)素的炎癥抑制和神經(jīng)保護(hù)作用， 研究方法： （一）動(dòng)物實(shí)驗(yàn)部分：利用MOG35-55抗原多肽免疫C57BL/6小鼠建立EAE動(dòng)物模型，分為對(duì)照組、EAE組和米諾環(huán)素治療組，分別在動(dòng)物發(fā)病前期（～免疫后9天）、發(fā)病初期（免疫后12～17天）、發(fā)病高峰期（免

2、疫后21～25天）和慢性維持期（免疫后32天～）處死動(dòng)物，取腦組織和脊髓。用組織學(xué)方法進(jìn)行HE染色、LFB染色和Bielschowsky染色；免疫組化方法檢測(cè)Iba1、APP和NF蛋白；RT-PCR方法檢測(cè)IFN-γ和IL-10 mRNA含量；Western Blot方法檢測(cè)p-p38 MAPK蛋白含量。 （二）細(xì)胞實(shí)驗(yàn)部分：建立小膠質(zhì)細(xì)胞體外培養(yǎng)模型，分為對(duì)照組、LPS活化組和米諾環(huán)素干預(yù)組，分別在3、6、12、24和48小時(shí)

3、取各組細(xì)胞培養(yǎng)液。利用ELISA方法檢測(cè)TNF-α和IL-1β蛋白含量，Griess Reagent方法檢測(cè)NO含量。 研究結(jié)果： （一）動(dòng)物實(shí)驗(yàn)部分： 1、實(shí)驗(yàn)小鼠的臨床神經(jīng)功能變化：對(duì)照組小鼠未發(fā)??；EAE組和治療組小鼠在免疫后12～17天相繼發(fā)病，臨床表現(xiàn)無(wú)差異，治療組開始用藥；21～25天到發(fā)病高峰期，EAE組較治療組小鼠臨床癥狀明顯加重；32天后進(jìn)入維持期，兩組癥狀持續(xù)，治療組癥狀較輕，疾病呈典型的慢性

4、非緩解性特點(diǎn)。 2、實(shí)驗(yàn)小鼠腦組織和脊髓的神經(jīng)病理變化：EAE組小鼠在發(fā)病高峰期HE染色見(jiàn)多個(gè)部位血管炎，血管周圍大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，成“袖套”樣改變，小血管明顯擴(kuò)張；LFB染色見(jiàn)白質(zhì)疏松，髓鞘不連續(xù)、斷裂、空泡樣改變，部分區(qū)域髓鞘呈現(xiàn)白色片狀脫失；APP免疫組化染色可見(jiàn)到軸索急性損傷后的異常染色；Iba-1免疫組化染色見(jiàn)到激活的小膠質(zhì)細(xì)胞變大腫脹，出現(xiàn)突起，并數(shù)量增多；在EAE慢性維持期，Bielschowsky染色可見(jiàn)軸索腫脹

5、粗細(xì)不等、斷裂和變形，以及軸索卵形體的形成；NF免疫組化染色可見(jiàn)軸索結(jié)構(gòu)變細(xì)、斷裂、變形、甚至缺失。治療組小鼠在相應(yīng)發(fā)病期的病理上均有明顯減輕。 3、實(shí)驗(yàn)小鼠在各時(shí)間點(diǎn)腦組織和脊髓內(nèi)炎性因子mRNA表達(dá)的變化：①IFN-γ mRNA表達(dá)的變化：對(duì)照組有少量IFN-γ mRNA的表達(dá)，在各時(shí)期表達(dá)也無(wú)變化。EAE組發(fā)病前期表達(dá)與對(duì)照組無(wú)差異，在發(fā)病初期表達(dá)顯著升高，并維持至發(fā)病高峰期，升高幅度達(dá)8～6倍，到慢性維持期以后，表達(dá)明顯

6、減弱，但仍高于對(duì)照組。治療組小鼠表達(dá)在發(fā)病初期與EAE組無(wú)差異，但在高峰期表達(dá)明顯減少，維持期的表達(dá)仍較EAE組減少，幾乎回到對(duì)照組水平。②IL-10 mRNA表達(dá)的變化：對(duì)照組有少量IL-10 mRNA的表達(dá)，在各時(shí)期表達(dá)也無(wú)變化。EAE組發(fā)病前期表達(dá)與對(duì)照組無(wú)差異，在發(fā)病初期表達(dá)開始升高，并維持至發(fā)病高峰期，到慢性維持期以后，表達(dá)繼續(xù)增高達(dá)6倍左右。治療組小鼠表達(dá)在發(fā)病初期與EAE組無(wú)差異，但在高峰期表達(dá)明顯增高，到慢性維持期表達(dá)仍

7、較EAE組明顯增高。 4、實(shí)驗(yàn)小鼠在發(fā)病高峰期腦組織和脊髓內(nèi)p-p38 MAPK蛋白表達(dá)的變化：對(duì)照組有少量p-p38 MAPK蛋白的表達(dá)；EAE組的表達(dá)明顯升高，達(dá)3倍左右；治療組的表達(dá)顯著降低，但仍較對(duì)照組組為高。 （二）細(xì)胞實(shí)驗(yàn)部分： 1、小膠質(zhì)細(xì)胞體外培養(yǎng)生長(zhǎng)情況：培養(yǎng)的小膠質(zhì)細(xì)胞為圓形、折光性強(qiáng)的小細(xì)胞，經(jīng)FITC-IB4標(biāo)記鑒定，純度達(dá)95％以上。用LPS激活活化后，形態(tài)上細(xì)胞胞體相對(duì)增大，呈巨噬細(xì)胞

8、樣，伴有多個(gè)細(xì)長(zhǎng)的突起。 2、各時(shí)間點(diǎn)小膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞毒性因子表達(dá)的變化：對(duì)照組正常細(xì)胞生長(zhǎng)環(huán)境中也有少量存在，其產(chǎn)生也具有時(shí)間依賴性?；罨M細(xì)胞經(jīng)LPS激活后產(chǎn)生的TNF-α水平升高最早，在3小時(shí)已有顯著增高；IL-1β在6小時(shí)才出現(xiàn)顯著性升高；而NO最晚，直到12小時(shí)才出現(xiàn)顯著性升高。干預(yù)組中的TNF-α在3～48小時(shí)各時(shí)間點(diǎn)均可見(jiàn)到其含量較活化組顯著下降；IL-1β在6～48小時(shí)時(shí)間點(diǎn)可見(jiàn)含量到較活化組顯著下降；而NO在