活化小膠質(zhì)細(xì)胞參與癲癇發(fā)病的作用機(jī)制研究——IL-1β的重要作用.pdf

1、小膠質(zhì)細(xì)胞（microglia，MG）廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，正常狀態(tài)下，MG處于靜止?fàn)顟B(tài)，行使免疫監(jiān)視功能。前期的研究也曾證實(shí)，在臨床外科手術(shù)切除顳葉癲癇灶的標(biāo)本中，有大量增生和激活的MG，提示MG與癲癇的發(fā)病密切相關(guān)。另?yè)?jù)報(bào)道很多細(xì)胞因子與癲癇的發(fā)病有關(guān)，如IL-1β和IL-6在致癇大鼠大腦皮質(zhì)及海馬內(nèi)表達(dá)增加；而在MG與神經(jīng)元混合培養(yǎng)的體外實(shí)驗(yàn)研究中，用脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）或干擾素-γ（inter

2、feron-γ，ITF-γ）活化的MG與神經(jīng)元混合培養(yǎng)可加劇神經(jīng)元損傷，加入IL-1受體拮抗劑（receptor antagonist，IL-1ra）或NMDA受體拮抗劑MK-801后可顯著改善這種效應(yīng)，表明NMDA受體和IL-1受體均參與了MG介導(dǎo)的神經(jīng)毒性。雖然目前已關(guān)注到癲癇的病理機(jī)制與MG之間有密切的關(guān)系，但在癲癇病程中，活化的MG通過(guò)何種途徑或物質(zhì)影響神經(jīng)元的興奮性尚未徹底闡明。根據(jù)上述提示的研究資料我們推測(cè)，活化的MG有可能

3、通過(guò)產(chǎn)生和分泌過(guò)量的生物活性物質(zhì)，包括IL-1β，而參與癲癇的病理過(guò)程。因此，本研究以海人酸（kainic acid，KA）為激活劑，以美滿霉素（minocycline）為抑制MG活化的工具藥，以IL-1β抗體或IL-1受體拮抗劑拮抗IL-1β的效應(yīng)，通過(guò)離體和在體實(shí)驗(yàn)，模擬癲癇發(fā)作時(shí)MG的活化狀態(tài)，探討MG活化后及所產(chǎn)生的IL-1β在癲癇發(fā)生發(fā)展中的作用及相關(guān)機(jī)制，以期為癲癇發(fā)病機(jī)制研究提供新的實(shí)驗(yàn)資料，為抗癇藥物研制提示新的作用靶點(diǎn)

4、。本研究共分四個(gè)部分。
　　 第一部分、KA對(duì)MG的激活作用及與IL-1β產(chǎn)生的關(guān)系
　　 為了探討癲癇狀態(tài)下MG的活化及與IL-1β產(chǎn)生的關(guān)系，本實(shí)驗(yàn)先分離純化培養(yǎng)新生大鼠大腦皮質(zhì)MG，再以KA 激活MG 或以美滿霉素預(yù)處理抑制MG的活化，然后應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法觀察MG特異性標(biāo)志物OX-42的表達(dá)變化；采用Elisa法測(cè)定MG條件培養(yǎng)液內(nèi)IL-1β的含量；采用RT-PCR法檢測(cè)MG內(nèi)IL-1βmRNA的表達(dá)變化。免疫

5、組織化學(xué)結(jié)果顯示，KA作用MG2h后，MG出現(xiàn)顯著的胞體增大、突起回縮的形態(tài)學(xué)改變，MG內(nèi)OX-42的免疫反應(yīng)較正常組和美滿霉素+KA組明顯增強(qiáng)（P<0.01）。Elisa檢測(cè)結(jié)果顯示，MG條件培養(yǎng)液中IL-1β的含量在KA組中明顯高于正常組（P<0.01）；而美滿霉素+KA組IL-1β的含量則明顯低于KA組（P<0.01）。RT-PCR結(jié)果顯示，MG內(nèi)IL-1βmRNA的含量在KA組中明顯高于正常組（P<0.01）；而在美滿霉素+KA

6、組則顯著低于KA組（P<0.01）。結(jié)果提示，KA對(duì)MG有顯著的激活作用，激活的MG 產(chǎn)生IL-1β顯著增多。MG抑制劑美滿霉素能阻遏上述效應(yīng)。
　　 第二部分、活化的MG條件培養(yǎng)液對(duì)大鼠癲癇發(fā)作行為學(xué)和海馬神經(jīng)元電生理特性的影響
　　 在前面的實(shí)驗(yàn)已證實(shí)，KA能顯著激活MG 并致其產(chǎn)生和分泌IL-1β增多。推測(cè)活化的MG有可能通過(guò)過(guò)量產(chǎn)生的IL-1β而影響神經(jīng)元的興奮性進(jìn)而參與癲癇的發(fā)病。為了證實(shí)這一推測(cè)，本實(shí)驗(yàn)取三種

7、培養(yǎng)液:即正常MG條件培養(yǎng)液（UT-MCM）、KA 激活的MG條件培養(yǎng)液（KA-MCM）、用IL-1β抗體預(yù)處理的KA-MCM（IL-1 β抗體＋KA-MCM），分別行大鼠側(cè)腦室注射，觀察大鼠行為學(xué)改變和腦電圖的變化；行大鼠海馬CA3 區(qū)注射，記錄其誘發(fā)電位的改變；再取上述三組培養(yǎng)液孵育離體培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元，以全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)檢測(cè)其鈣電流的變化。結(jié)果：(1)行為學(xué)觀察：UT-MCM組大鼠無(wú)明顯的癇性發(fā)作；KA-MCM組大鼠表現(xiàn)為癲癇發(fā)作

8、Ⅲ～Ⅳ級(jí)；IL-1β抗體＋KA-MCM組大鼠表現(xiàn)為癲癇發(fā)作Ⅰ～Ⅱ級(jí)。(2)EEG結(jié)果證實(shí)：UT-MCM行側(cè)腦室注射后大腦皮質(zhì)EEG 顯示為平穩(wěn)的基礎(chǔ)波；KA-MCM組有頻發(fā)異常高電位腦電波的出現(xiàn)；IL-1β抗體＋KA-MCM組癇性異常放電明顯減弱，波幅及頻率均較KA-MCM組低。(3)海馬誘發(fā)電位顯示：KA-MCM組海馬群峰電位（PS）的相對(duì)幅度與UT-MCM組比較顯著升高，差異有顯著性(P<0.01)；IL-1β抗體＋KA-MCM組P

9、S的幅度較KA-MCM組顯著下調(diào)（P<0.05)。(4)膜片鉗結(jié)果顯示：KA-MCM組較UT-MCM組電流幅度和電流密度顯著增高(P<0.01)，IL-1β抗體＋KA-MCM組電流幅度和電流密度較KA-MCM組顯著下降，但仍高于UT-MCM組(P<0.05)。以上結(jié)果表明，活化的MG 產(chǎn)生的生物活性物質(zhì)能夠?qū)е掳d癇的發(fā)生，其機(jī)制與增強(qiáng)神經(jīng)元的興奮性，增加神經(jīng)元鈣內(nèi)流有關(guān)。而IL-1 β在這一過(guò)程中扮演重要的角色。
　　 第三部分

10、、活化的MG條件培養(yǎng)液對(duì)大鼠海馬神經(jīng)元iNOS和NMDAR1表達(dá)的影響
　　 文獻(xiàn)表明，IL-1β對(duì)神經(jīng)元的促興奮性效應(yīng)可能不僅通過(guò)活化NMDAR和非NMDAR，介導(dǎo)Ca2+內(nèi)流而產(chǎn)生快速作用，而且還可通過(guò)產(chǎn)生其他活性物質(zhì)或激活有關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路等多種途徑進(jìn)一步參與神經(jīng)元興奮毒性損傷過(guò)程。有研究資料提示IL-1β的異常增加產(chǎn)生的促癇效應(yīng)可能與iNOS、NMDAR的表達(dá)增高有關(guān)。我們?cè)诘诙糠謱?shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)，KA激活的小膠質(zhì)細(xì)胞條件培

11、養(yǎng)液能夠促進(jìn)電壓依賴性鈣通道（VDCC）的開(kāi)放，引起Ca2+內(nèi)流致神經(jīng)元興奮性增強(qiáng)進(jìn)而誘發(fā)癲癇的發(fā)生，那么活化MG 來(lái)源的IL-1β是否對(duì)神經(jīng)元內(nèi)iNOS和NMDAR1 產(chǎn)生影響而參與癲癇的病理過(guò)程呢？為了探明這個(gè)問(wèn)題，本實(shí)驗(yàn)以三種不同的MG條件培養(yǎng)液即UT-MCM、KA-MCM、IL-1β抗體＋KA-MCM作為刺激因素，分別行大鼠側(cè)腦室注射或孵育離體培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元，采用Western Blot 或RT-PCR技術(shù)分別檢測(cè)大鼠海馬組織

12、或培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元中iNOS和NMDAR1表達(dá)的變化。Western Blot結(jié)果顯示KA-MCM組大鼠海馬組織中iNOS和NMDAR1的蛋白表達(dá)水平較UT-MCM組顯著升高(P<0.01)，IL-1β抗體＋KA-MCM組較KA-MCM組明顯減弱(P<0.01)，但仍然高于UT-MCM組(P<0.01)。RT-PCR結(jié)果顯示，與UT-MCM組相比，培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元中iNOS和NMDAR1的mRNA表達(dá)在KA-MCM組中顯著升高(P<0.

13、01)，而用IL-1β抗體預(yù)處理的IL-1β抗體＋KA-MCM組較KA-MCM組則顯著下降(P<0.01)。離體海馬神經(jīng)元與在體海馬組織中iNOS和NMDAR1的表達(dá)變化基本一致。結(jié)果提示，KA活化的MG條件培養(yǎng)液中IL-1β能顯著上調(diào)大鼠海馬神經(jīng)元iNOS和NMDAR1的表達(dá)。
　　 第四部分、活化的MG條件培養(yǎng)液對(duì)培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)的影響
　　 氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)學(xué)說(shuō)在癲癇的發(fā)作與治療中占有主導(dǎo)地位，谷氨

14、酸（glutamate，Glu）和γ-氨基丁酸（aminobutyric acid，GABA）分別是腦內(nèi)最主要的興奮性和抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，它們廣泛地分布于各腦區(qū)，二者在功能上協(xié)調(diào)一致，共同維持著神經(jīng)元興奮與抑制的平衡，在代謝上密切相關(guān)，并可循環(huán)轉(zhuǎn)換。我們?cè)诘诙糠趾偷谌糠值膶?shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，活化MG 來(lái)源的IL-1β參與了癲癇的發(fā)生，其機(jī)制與Ca2+內(nèi)流增加，NMDAR1和iNOS表達(dá)升高有關(guān)，而這三者與Glu和GABA 都有著功能或代謝上的

15、某些聯(lián)系，提示通過(guò)IL-1β介導(dǎo)的活化的MG與神經(jīng)元之間的相互作用也可能影響神經(jīng)元Glu和GABA的分泌和產(chǎn)生。因此，本實(shí)驗(yàn)用三種培養(yǎng)液:即UT-MCM、KA-MCM、IL-1受體拮抗劑（IL-1ra）＋KA-MCM分別孵育離體培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元，再收集三組神經(jīng)元培養(yǎng)液，采用高效液相色譜技術(shù)檢測(cè)各組海馬神經(jīng)元Glu和GABA 分泌量的變化。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與UT-MCM組比較，KA-MCM組Glu的分泌量顯著增多(P<0.01)，GABA分泌顯

16、著減少（P<0.01)，二者比例失衡。而用IL-1ra 預(yù)處理的KA-MCM作用于海馬神經(jīng)元后，則顯著減弱海馬神經(jīng)元中Glu的分泌(P<0.05)，增加GABA的分泌(P<0.05)。結(jié)果表明，KA活化的MG條件培養(yǎng)液促進(jìn)Glu的分泌，減少GABA的分泌，使二者比例失調(diào)，而IL-1ra對(duì)此效應(yīng)有拮抗作用。
　　 小結(jié)：本研究表明，KA對(duì)MG有顯著的激活作用，激活的MG 產(chǎn)生IL-1β顯著增多。用三種不同的MG條件培養(yǎng)液：即UT-

17、MCM、KA-MCM、IL-1β抗體或IL-1ra＋KA-MCM，行大鼠側(cè)腦室注射或孵育培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元，電生理研究證實(shí)：KA活化的MG條件培養(yǎng)液能夠誘發(fā)癲癇的發(fā)生，產(chǎn)生癇性腦電波，使海馬CA3 區(qū)誘發(fā)電位增強(qiáng)，并可明顯增強(qiáng)電壓依賴性的鈣電流；分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)證實(shí)：KA活化的MG條件培養(yǎng)液能上調(diào)NMDAR1和iNOS的表達(dá)；生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，KA活化的MG條件培養(yǎng)液可促進(jìn)神經(jīng)元Glu分泌，減少GABA的分泌，使二者比例失調(diào)。而用IL-1β