版權(quán)說明:本文檔由用戶提供并上傳,收益歸屬內(nèi)容提供方,若內(nèi)容存在侵權(quán),請(qǐng)進(jìn)行舉報(bào)或認(rèn)領(lǐng)
文檔簡(jiǎn)介
1、本文主要從以下幾方面進(jìn)行論述:
第一部分 MEF2D對(duì)DYRK1A的轉(zhuǎn)錄調(diào)控
研究目的:
研究DYRK1A不同異構(gòu)體在神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中的特異性表達(dá)情況,以及MEF2D對(duì)DYRK1A不同異構(gòu)體的轉(zhuǎn)錄調(diào)控,明確其分子調(diào)控機(jī)制,并進(jìn)一步探索MEF2D對(duì)DYRK1A的調(diào)控作用與神經(jīng)發(fā)育之間的關(guān)系。
研究方法:
1.在人腦膠質(zhì)瘤T98G細(xì)胞系中研究轉(zhuǎn)錄因子MEF2D對(duì)DYRK1A基因不同異構(gòu)體的
2、轉(zhuǎn)錄調(diào)控。應(yīng)用LipofectamineTM2000分別將MEF2D表達(dá)質(zhì)粒pCMV6-entry-MEF2D及空白對(duì)照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入T98G細(xì)胞,48小時(shí)后將細(xì)胞收集起來,應(yīng)用TRIzol法提取細(xì)胞中的RNA,并使用Takara PrimeScriptTM逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將提取的RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,進(jìn)一步通過逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測(cè)內(nèi)源性DYRK1A mRNA不同異構(gòu)體的表達(dá)變化;應(yīng)用SYBR Green法實(shí)時(shí)熒光定量PCR
3、(Real-time RT-PCR)法再次檢測(cè)DYRK1A不同異構(gòu)體的表達(dá)情況并進(jìn)行分析。
2.MEF2D對(duì)DYRK1A啟動(dòng)子活性調(diào)控。
2.1 DYRK1A啟動(dòng)子質(zhì)粒的構(gòu)建:利用PCR技術(shù)從提取的人類基因組中擴(kuò)增DYRK1A的啟動(dòng)子序列,并將其克隆到無啟動(dòng)子活性的pGL3-Basic載體中,或者啟動(dòng)子質(zhì)粒pDYluc-long;
2.2 MEF2D高表達(dá)及敲除siRNA效果檢測(cè)。應(yīng)用Lipofectami
4、neTM2000將MEF2D表達(dá)質(zhì)粒及敲除siRNA分別與空白對(duì)照轉(zhuǎn)染入T98G細(xì)胞,轉(zhuǎn)染后48小時(shí)收集細(xì)胞并裂解,蛋白定量后應(yīng)用Western Blot檢測(cè)MEF2D以及DYRK1A的表達(dá)變化,β-ACTIN作為內(nèi)參;
2.3 應(yīng)用LipofectamineTM2000將pCMV6-entry-MEF2D及空白對(duì)照質(zhì)粒、MEF2D敲除siRNA及空白對(duì)照分別與pDYluc-long及pGL3-Basic質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入HEK293
5、細(xì)胞,48小時(shí)后裂解細(xì)胞并應(yīng)用Luciferase Assay技術(shù)檢測(cè)啟動(dòng)子活性。
3.尋找并確認(rèn)DYRK1A啟動(dòng)子功能性DY-MRE(MEF2D responsiveelement)位點(diǎn)。
3.1 MEF2D結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測(cè):http://jaspar.genereg.net/網(wǎng)站中輸入DYRK1A啟動(dòng)子區(qū)序列,預(yù)測(cè)MEF2D的可能結(jié)合位點(diǎn);
3.2 分別構(gòu)建含有DYRK1A啟動(dòng)子不同區(qū)域截短體的熒光素酶載體
6、,應(yīng)用LipofectamineTM2000將pCMV6-entry-MEF2D及空白對(duì)照質(zhì)粒分別與不同截短體載體及pGL3-Basic質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞,48小時(shí)候收集細(xì)胞并裂解,應(yīng)用Luciferase Assay分析不同截短體在MEF2D作用下的啟動(dòng)子活性變化;
3.3 構(gòu)建包含預(yù)測(cè)DY-MRE的載體及對(duì)應(yīng)的突變載體,轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞并通過Luciferase Assay再次確認(rèn)MRE的活性。
4.
7、在動(dòng)物模型中研究MEF2D與DYRK1A之間的關(guān)系。分別取胚胎期為13.5天(E13.5)、18天(E18)及出生后1、7、14天(P0,P7,P14)的多只小鼠的大腦皮層,應(yīng)用TRIzol法提取組織中的RNA,進(jìn)一步應(yīng)用TakaraPrimeScriptTM反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA,結(jié)合SYBR Green法實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)樣本中MEF2D及總DYRK1A的mRNA表達(dá)情況。
研究結(jié)果:
1.MEF2D
8、可以特異性上調(diào)DYRK1A的mRNA總量DYRK1A isoform5的表達(dá)量,對(duì)DYRK1A isoform2,3的mRNA表達(dá)量并無影響。T98G以及HEK293細(xì)胞中可以檢測(cè)到DYRK1A isoform1和5以及MEF2D的蛋白表達(dá)。
2.MEF2D通過增強(qiáng)DYRK1A isoform5的啟動(dòng)子活性上調(diào)DYRK1A mRNA的表達(dá)。
2.1 MEF2D高表達(dá)后顯著上調(diào)DYRK1A啟動(dòng)子活性;
2.2
9、 MEF2D被敲減后,DYRK1A啟動(dòng)子活性與對(duì)照相比顯著降低。
3.DYRK1A基因啟動(dòng)子上MEF2D功能性位點(diǎn)DY-MRE的確定。
3.1 通過Jaspar網(wǎng)站對(duì)DYRK1A啟動(dòng)子區(qū)域序列進(jìn)行分析,獲得可能的MEF2D結(jié)合位點(diǎn);
3.2 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)方法檢測(cè)DYRK1A啟動(dòng)子不同區(qū)截短體質(zhì)粒在MEF2D高表達(dá)時(shí)啟動(dòng)子活性的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)包含-442~-254 bp位點(diǎn)的啟動(dòng)子活性可以被MEF2
10、D上調(diào),通過Jaspar序列分析發(fā)現(xiàn),該區(qū)域包含一個(gè)可能的功能性MEF2D結(jié)合位點(diǎn),位于-268~-254 bp;
3.3 分別構(gòu)建包含-268~-254 bp及對(duì)應(yīng)突變的啟動(dòng)子載體,結(jié)合雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)方法證實(shí)該段區(qū)域啟動(dòng)子活性可被MEF2D特異性上調(diào),關(guān)鍵堿基突變后,MEF2D對(duì)啟動(dòng)子活性的上調(diào)作用消失。
4.DYRK1A與MEF2D在正常小鼠大腦神經(jīng)發(fā)育過程中mRNA表達(dá)呈正相關(guān)性。當(dāng)MEF2D表達(dá)較高時(shí)
11、,DYRK1A表達(dá)水平也相應(yīng)較高,而當(dāng)MEF2D表達(dá)量較低時(shí),DYRK1A的表達(dá)量隨之降低,通過斯皮爾曼相關(guān)系數(shù)計(jì)算證實(shí)p=0.0478,r=0.6182。結(jié)果提示MEF2D與DYRK1A在大腦的神經(jīng)發(fā)育過程中可能存在協(xié)同作用。
研究結(jié)論:
1.MEF2D可以特異性上調(diào)人DYRK1A isoform5的轉(zhuǎn)錄。
2.人DYRK1A基因啟動(dòng)子活性可被MEF2D上調(diào),-268~-254 bp處的DYMRE位點(diǎn)可與
12、MEF2D特異性結(jié)合,激活DYRK1A的啟動(dòng)子活性。
3.MEF2D與DYRK1A在正常小鼠的大腦皮層神經(jīng)發(fā)育過程中,mRNA的表達(dá)量呈正相關(guān)性。
4.在神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中,MEF2D通過特異性上調(diào)DYRK1A的表達(dá)降低NFATc2的蛋白表達(dá)量。
第二部分 DYRK1A對(duì)MEF2D的磷酸化修飾及功能影響
研究目的:
研究雙底物特異性酪氨酸磷酸化調(diào)節(jié)激酶A(DYRK1A)對(duì)轉(zhuǎn)錄因子MEF2
13、D的磷酸化修飾,探尋修飾位點(diǎn)及作用機(jī)制,明確MEF2D磷酸化修飾對(duì)其功能的影響。
研究方法:
1.在人胚腎HEK293細(xì)胞研究DYRK1A對(duì)MEF2D的磷酸化作用。應(yīng)用LipofectamineTM2000將pCMV6-entry-MEF2D表達(dá)質(zhì)粒分別與pCMV6-entry-DYRK1A表達(dá)質(zhì)粒及空白對(duì)照質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染入HEK293細(xì)胞,轉(zhuǎn)染后48小時(shí)收集并裂解細(xì)胞,應(yīng)用Western Blot檢測(cè)MEF2D的表達(dá)情
14、況。
2.通過質(zhì)譜檢測(cè),尋找并分析MEF2D蛋白被DYRK1A磷酸化的位點(diǎn)。
2.1 構(gòu)建MEF2D的原核表達(dá)載體。MEF2D表達(dá)序列全長(zhǎng)521個(gè)氨基酸,將其克隆入pET32a(+)載體中,得到pET32a-MEF2D質(zhì)粒,測(cè)序驗(yàn)證其正確表達(dá);
2.2 將構(gòu)建好的pET32a-MEF2D轉(zhuǎn)化入感受態(tài)BL21細(xì)胞中進(jìn)行原核擴(kuò)增,并應(yīng)用適當(dāng)濃度的IPTG過夜誘導(dǎo),收集菌體并進(jìn)行過Ni-NTA柱純化;
15、2.3 對(duì)純化后的蛋白進(jìn)行BCA法蛋白定量,并應(yīng)用Western Blotting進(jìn)行檢測(cè),驗(yàn)證其原核表達(dá)的正確性。
3.DYRK1A對(duì)MEF2D蛋白轉(zhuǎn)錄活性的影響。
3.1 將MEF2D特異性識(shí)別位點(diǎn)的多拷貝序列(MRE)插入pGL3-Basic載體中,構(gòu)建p3×MRE載體;
3.2 應(yīng)用LipofectamineTM2000將DYRK1A表達(dá)載體、DYRK1A激酶失活載體DYRK1A(K188R)及空白
16、對(duì)照分別與pGL3-Basic和p3×MRE載體轉(zhuǎn)染入HEK293細(xì)胞中;
3.3 轉(zhuǎn)染48小時(shí)后收集樣品進(jìn)行Luciferase Assay檢測(cè),并分析檢測(cè)結(jié)果。
研究結(jié)果:
1.DYRK1A過量表達(dá)可以顯著升高外源MEF2D的表達(dá)水平,并使蛋白分子量發(fā)生改變,提示存在化學(xué)修飾。
2.純化MEF2D重組蛋白后進(jìn)行體外磷酸化反應(yīng)結(jié)合質(zhì)譜分析結(jié)果顯示,與空白對(duì)照相比,被DYRK1A處理過的MEF2D
17、蛋白樣品,位于251位的絲氨酸存在磷酸化修飾。
3.Luciferase Assay結(jié)果顯示,與pGL3-Basic相比,MEF2D可以顯著性升高p3×MRE載體的活性,但DYRK1A會(huì)使p3×MRE的活性降低,而失去激酶活性的DYRK1A不會(huì)使p3×MRE的活性降低。
4.被DYRK1A磷酸化的MEF2D,在NH4Cl的作用下,降解速率顯著降低。
研究結(jié)論:
1.DYRK1A升高M(jìn)EF2D的表達(dá)
溫馨提示
- 1. 本站所有資源如無特殊說明,都需要本地電腦安裝OFFICE2007和PDF閱讀器。圖紙軟件為CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.壓縮文件請(qǐng)下載最新的WinRAR軟件解壓。
- 2. 本站的文檔不包含任何第三方提供的附件圖紙等,如果需要附件,請(qǐng)聯(lián)系上傳者。文件的所有權(quán)益歸上傳用戶所有。
- 3. 本站RAR壓縮包中若帶圖紙,網(wǎng)頁內(nèi)容里面會(huì)有圖紙預(yù)覽,若沒有圖紙預(yù)覽就沒有圖紙。
- 4. 未經(jīng)權(quán)益所有人同意不得將文件中的內(nèi)容挪作商業(yè)或盈利用途。
- 5. 眾賞文庫僅提供信息存儲(chǔ)空間,僅對(duì)用戶上傳內(nèi)容的表現(xiàn)方式做保護(hù)處理,對(duì)用戶上傳分享的文檔內(nèi)容本身不做任何修改或編輯,并不能對(duì)任何下載內(nèi)容負(fù)責(zé)。
- 6. 下載文件中如有侵權(quán)或不適當(dāng)內(nèi)容,請(qǐng)與我們聯(lián)系,我們立即糾正。
- 7. 本站不保證下載資源的準(zhǔn)確性、安全性和完整性, 同時(shí)也不承擔(dān)用戶因使用這些下載資源對(duì)自己和他人造成任何形式的傷害或損失。
最新文檔
- 興義鴨MEF2A、MEF2B、MEF2C和MEF2D基因克隆與組織時(shí)空表達(dá)研究.pdf
- SCFβTrCP介導(dǎo)DYRK1A降解對(duì)細(xì)胞周期的調(diào)控與DYRK1A對(duì)AML細(xì)胞增殖的影響及機(jī)制研究.pdf
- MEF2D在活化的小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)及作用.pdf
- 鴨MEF2D基因編碼區(qū)克隆及其微衛(wèi)星多態(tài)與屠宰性能的關(guān)聯(lián)分析.pdf
- 線粒體MEF2D氧化修飾水平變化在PD發(fā)病中的作用.pdf
- 帕金森病相關(guān)的神經(jīng)毒素對(duì)MEF2D mRNA的影響及其作用的研究.pdf
- 豬MSTN基因和MEF2D基因的多態(tài)性及其與胴體和肉質(zhì)性狀間關(guān)聯(lián)性研究.pdf
- MEF差異表達(dá)基因的篩選.pdf
- 肌細(xì)胞增強(qiáng)因子MEF2D在結(jié)直腸癌侵襲轉(zhuǎn)移中的作用和分子機(jī)制研究.pdf
- 豬MEF2A基因的克隆及表達(dá)規(guī)律的研究.pdf
- mef2基因家族與myomirs在鯉魚肌肉中的表達(dá)分析
- 運(yùn)動(dòng)對(duì)AMPK不同基因型小鼠骨骼肌PGC1-MEF2的影響.pdf
- BMP2在C2C12細(xì)胞系中對(duì)MEF1調(diào)節(jié)作用的研究.pdf
- 山羊MEF2C基因不同轉(zhuǎn)錄本的分離鑒定及表達(dá)模式研究.pdf
- 牛MBD1基因表達(dá)的表觀遺傳調(diào)節(jié)及其對(duì)發(fā)育相關(guān)基因的作用.pdf
- 齊墩果酸通過miR-122-CyclinG1-MEF2D對(duì)肺癌細(xì)胞增殖影響的研究.pdf
- 冠心病相關(guān)基因MEF2A的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)及其突變型真核表達(dá)載體的構(gòu)建和體外活性研究.pdf
- SIRT1調(diào)節(jié)EZH2的表達(dá)并且影響PcG對(duì)靶基因SATB1的轉(zhuǎn)錄調(diào)控.pdf
- 紅景天苷通過調(diào)節(jié)MEF2D-ND6通路保護(hù)多巴胺神經(jīng)元.pdf
- 豬CACNA2D1基因的研究.pdf
評(píng)論
0/150
提交評(píng)論