枯草牙孢桿菌nja-9理化誘變及SubtilosinA的結(jié)構(gòu)鑒定.pdf

1、近年來(lái)，開(kāi)發(fā)抗菌性強(qiáng)、安全無(wú)毒和性能穩(wěn)定的天然抗菌物質(zhì)已成為科學(xué)研究的一個(gè)熱點(diǎn)，枯草芽胞桿菌(Bacillu subtilis)是一類嗜溫、好氧或兼性厭氧、能夠產(chǎn)生內(nèi)生胞子的革蘭氏陽(yáng)性桿狀細(xì)菌，它能產(chǎn)生多種抗菌物質(zhì)，包括脂肽類、磷脂類、蛋白類、多烯類等等，這些抗菌物質(zhì)能抑制真菌、細(xì)菌、病毒和菌原體等的正常生長(zhǎng)，具有較廣泛的實(shí)際應(yīng)用。
　　 本實(shí)驗(yàn)從堆肥里分離得到一株對(duì)革蘭氏陽(yáng)性和陰性均有較強(qiáng)抗菌活性的Bacillussubtil

2、is nja-9，本研究旨在通過(guò)理化方法誘變此菌株，得到一株活性高且穩(wěn)定性好的菌株，進(jìn)而對(duì)其所產(chǎn)生抗菌物質(zhì)進(jìn)行分離純化和穩(wěn)定性研究，并通過(guò)MS、IR和UV等技術(shù)手段鑒定抗菌物質(zhì)的結(jié)構(gòu)。本文主要研究結(jié)果如下:
　　 1.Bacillus subtilis nja-9理化誘變研究:通過(guò)測(cè)定枯草芽孢桿菌nja-9生長(zhǎng)曲線和產(chǎn)抗菌物質(zhì)的動(dòng)態(tài)曲線，確定其發(fā)酵時(shí)間是24 h;采用亞硝基胍、甲基磺酸乙酯、氯化鋰和低能氮離子束注入同時(shí)對(duì)其進(jìn)行誘

3、變，其中亞硝基胍、甲基磺酸乙酯、氯化鋰誘變最佳濃度分別是0.25 mg/mL、0.6 mol/mL、4％，在10 kev能量下，低能氮離子注入時(shí)間10 s。經(jīng)過(guò)多次篩選，從1250株菌中得到一株其抑菌活性較高且遺傳穩(wěn)定性好的誘變菌N133，其抗菌物質(zhì)對(duì)熒光假單胞菌的抑菌圈直徑是23.23mm，較野生菌株提高了6.9％，故作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的出發(fā)菌株;通過(guò)測(cè)定不同培養(yǎng)基發(fā)酵的抑菌效果，選擇LB作為下一步實(shí)驗(yàn)的發(fā)酵培養(yǎng)基。
　　 2.Ba

4、cillus subtilis N133產(chǎn)抗菌物質(zhì)分離純化及性質(zhì)研究:將酸沉、有機(jī)溶劑萃取和乙醇沉淀三種粗提取方法進(jìn)行比較，最終采用酸沉作為粗提取的手段;通過(guò)Sephadex LH-20層析的方法純化甲醇粗提液，得到一組活性成分，初步判定是Surfactin同系物;研究N133甲醇粗提液的穩(wěn)定性，結(jié)果顯示該抗菌物質(zhì)在酸性條件下穩(wěn)定，隨pH上升其活性有所下降;在100℃處理2h后其抑菌圈出現(xiàn)顯著的減小，120℃處理20 min后抑菌圈直徑

5、與對(duì)照相比減小了25.55％左右，熱穩(wěn)定性較好;在紫外照射下活性穩(wěn)定。
　　 3.Bacillus subtilis N133產(chǎn)抗菌物質(zhì)結(jié)構(gòu)鑒定:將甲醇粗提液全波長(zhǎng)掃描，最大紫外吸收波長(zhǎng)是210nm，則將210nm作為HPLC和LC-MS的檢測(cè)波長(zhǎng);通過(guò)LC-MS，得到一組分子量分別是994 Da、1008 Da、1022 Da和1036 Da，并且與Surfactin標(biāo)品的HPLC圖譜對(duì)比，斷定N133抗菌物質(zhì)中含有Surfa

6、ctin同系物;另外，通過(guò)采用酸沉、甲醇提取、半制備型HPLC收集等一系列分離純化步驟，從N133的發(fā)酵液中成功分離得到另一種廣譜抗菌物質(zhì)，全波長(zhǎng)掃描結(jié)果顯示該抗菌物質(zhì)含有氨基酸基團(tuán);MALDI-MS實(shí)驗(yàn)確定該抗菌物質(zhì)的分子量時(shí)3401 Da，已報(bào)道的SubtilosinA的分子量一致;IR結(jié)果顯示該物質(zhì)是一類由C、H、O、N組成的物質(zhì)，且含有-CH3、-CH2、-CO-NH-和苯環(huán)等基團(tuán)，MS/MS結(jié)果表明該物質(zhì)在在碰撞誘導(dǎo)解離(CI

7、D)下包含得到的MS/MS離子峰有m/z3022.197、2447.522、2245.937、1507.724、1049.769、765.244、262.053等若干離子碎片峰，確定活性峰3是SubtilosinA。以相同濃度的Nisin標(biāo)品為對(duì)照，測(cè)定了SubtilosinA的抑菌譜，表明SubtilosinA比Nisin具有更好的抑菌活性，其中，對(duì)熒光假單胞菌、綠膿桿菌、藤黃微球菌、短小芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌具有很強(qiáng)的抑菌活性，對(duì)大