大鼠谷氨酰胺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白SNAT2的N末端區(qū)域?qū)NAT2定位于細(xì)胞膜上作用的研究.pdf

1、谷氨酰胺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中一種重要的中性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，對谷氨酰胺的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)十分重要。為了更方便地研究大鼠谷氨酰胺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2(SNAT2)在細(xì)胞膜上的表達(dá)與定位，利用亞克隆技術(shù)將增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(EGFP)構(gòu)建于SNAT2的C-端，通過菌液PCR、酶切和DNA測序等方法鑒定SNAT2-EGFP融合蛋白表達(dá)載體的正確構(gòu)建；將構(gòu)建正確的融合蛋白SNAT2-EGFP表達(dá)載體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染人胚胎腎細(xì)胞(HEK293Tcells)，用Weste

2、rnblot和激光共聚焦電子顯微鏡熒光檢測技術(shù)鑒定SNAT2-EGFP的在細(xì)胞膜上的表達(dá)與定位。為了深入研究SNAT2的N末端區(qū)域?qū)NAT2于細(xì)胞膜上定位的作用，利用定點(diǎn)突變的方法截取SNAT2的前5個(gè)氨基酸獲得突變體M1G-SNAT2-EGFP，利用限制性酶切、連接等方法將SNAT2于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的整個(gè)N末端即前74個(gè)氨基酸截去，獲得SNAT2DelN-ter-EGFP。用Westernblot和激光共聚焦電子顯微鏡熒光檢測技術(shù)鑒定Ml

3、G-SNAT2-EGFP和SNAT2DelN-ter-EGFP的在細(xì)胞膜上的表達(dá)與定位，運(yùn)用反轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)的方法，檢測MlG-SNAT2-EGFP和SNAT2DelN-ter-EGFP轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)。結(jié)果表明：SNAT2-EGFP融合蛋白重組質(zhì)粒在細(xì)胞中表達(dá)并正確定位于細(xì)胞膜上；突變體蛋白MlG-SNAT2-EGFP正常表達(dá)并定位于細(xì)胞膜上，與SNAT2-EGFP無差異，截去N末端的蛋白SNAT2DelN-ter-EGFP