谷氨酰胺對脂多糖致大鼠心功能障礙的保護作用研究.pdf

1、目的:
　　 膿毒癥早期即存在心血管功能異常,尤其是嚴重膿毒癥和膿毒癥休克患者,有50％存在左室收縮/舒張功能異常。關于膿毒癥繼發(fā)心功能障礙的機制復雜多樣,主要與細菌內毒素(主要成分為脂多糖LPS)激活血管內皮、中性粒細胞、單核巨噬細胞系統(tǒng),進而激活凝血、補體激肽系統(tǒng)等,釋放多種炎癥介質和細胞因子如腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細胞介素-1β(IL-1β)、溶酶體、一氧化氮(NO)等有關,這些心肌抑制因子(MDS)可以直接損

2、傷心肌細胞,同時亦影響心肌線粒體、內質網(wǎng)代謝功能。此外膿毒癥時心肌細胞鈣循環(huán)障礙以及TNF-α誘導的心肌細胞凋亡等也促進了心功能障礙的發(fā)生。涉及面甚廣,難以從單一環(huán)節(jié)阻斷。
　　 Toll樣受體(TLR)能夠識別病原體,并在病原體入侵機體的早期啟動天然免疫,促進免疫細胞成熟分化及調節(jié)免疫應答,LPS激活TLR4的信號轉導通路后導致NF-κB激活,使炎癥因子大量表達,導致全身炎癥反應和多器官功能衰竭的發(fā)生。A20作為一種NF-κB

3、依賴性表達的胞質蛋白,對NF-κB活性有負反饋調控作用,參與了體內炎癥反應的調節(jié)和凋亡抑制。所以通過屏蔽TLR4或下調TLR4表達以阻斷感染的源頭;同時促進A20表達,抑制LPS信號轉導,成為近年來防治感染繼發(fā)心功能障礙研究的熱點。
　　 谷胺酰胺(Glutamine,Gln)作為體內最豐富的游離氨基酸,能夠通過誘導GSH合成及熱休克蛋白70表達以增強抗氧化物質活性、抑制NO的產(chǎn)生,是一種多靶點的心肌保護藥物。因此,Gln已經(jīng)作

4、為心肌缺血再灌注損傷保護劑及危重癥患者腸粘膜免疫屏障保護劑應用于臨床,甚至可以改善Sepsis患者的預后,證實該藥是安全可靠的。鑒于已有研究證實;Gln可以下調sepsis大鼠腸道粘膜TLR4信號通路表達,從而減輕腸粘膜損傷;Gln還可以減少I-κB的分解,抑制NF-κB的激活使促炎性細胞因子水平降低。簡言之,Gln可以在上游TLR4表達和下游NF-κB激活雙環(huán)節(jié)抑制TLR4信號傳導,從而減輕炎性損傷。同時戚仁斌等應用Gln進行大鼠離體

5、心臟主動脈逆灌流,對LPS損傷引起的心肌細胞單相動作電位幅度減小、MAPD及MAPD20延長、心肌張力降低、心率變慢等變化有明顯的改善作用,說明Gln對LPS所致心肌損傷有一定保護作用。因此我們通過應用LPS血癥大鼠模型,觀察作為抗氧化、免疫營養(yǎng)調理制劑應用的Gln能否通過抑制TLR4-NF-κB信號通路,抑制LPS信號轉導,減輕心肌損傷及心肌凋亡而保護心功能,以期為防治感染繼發(fā)心功能障礙提供有效輔助冶療藥物。
　　 方法：

6、r>　　 1.動物模型制備和實驗分組：健康清潔級SD大鼠90只,雄性,體質量(350±25)g隨機分為為3組：對照組10只;生理鹽水5ml/只;LPS組40只;L,PS10mg/kg(以生理鹽水稀釋至5ml);LPS+Gln組40只;LPS10mg/kg+Gln1g/kg(以生理鹽水稀釋至5m1)腹腔注射。于注藥后6、24、48、72h處死動物。
　　 2.腹腔注藥后6、24、48、72h后右頸總動脈插管至左心室,RM6240

7、BD多功能生理記錄儀測定平均血壓(MAP)、左室收縮末期壓力(LVESP)、左室壓力上升及下降最大變化速率(±dp/dtmax)等心功能指標。
　　 3.心尖組織固定、脫水、包埋,HE染色,觀察心肌病理學變化。
　　 4.RT-PCR檢測心肌TLR4、A20、TNF-αmRNA表達,Western-blotting法檢測TLR4、A20、NF-κB p65蛋白表達。
　　 5.RT-PCR檢測心肌Bax、Bcl-

8、2 mRNA表達,免疫組化方法測定心肌Bax、Bcl-2蛋白表達;TUNEL檢測心肌細胞凋亡水平;比色法測定Caspase-3活性。
　　 6.ELISA測定心肌TNF-α、血清CTnI、NT-ProBNP含量。
　　 結果：
　　 1.大鼠毒血癥表現(xiàn)：大鼠注射LPS6h后即出現(xiàn)倦怠、嗜睡,進食進水明顯減少,呼吸急促,松毛,眼鼻血性分泌物,腹瀉,體重下降。解剖見心臟擴大、雙肺淤血。
　　 2.心功能測定：

9、與對照組比較,LPS注射6h后即先后出現(xiàn)大鼠心臟+dp/dtmax、-dp/dtmax下降,且呈進行性下降趨勢,至72h回升。Gln可使不同時間點LVESP、+dp/dtmax、-dp/dtmax升高(P＜0.05)。
　　 3.病理檢查：LPS組大鼠心肌細胞水腫、變性壞死,Gln治療組心肌細胞損傷減輕。
　　 5.LPS組心肌組織TLR4、A20、TNF-αmRNA及TLR4、A20、NF-κBp65蛋白表達升高,LP

10、S+Gln24h組較LPS24h組有下降趨勢,差異顯著(P＜0.05)。
　　 6.LPS導致心肌Bel-2/Bax下降;Caspase-3活性及凋亡率明顯升高;Gln可提升心肌Bcl-2/Bax,降低Caspase-3活性及凋亡率(P＜0.05)。
　　 7.LPS組心肌TNF-α、血清CTnI、BNP濃度顯著升高,Gln能降低TNF-α、CTnI、NT-proBNP濃度,使TNF-α提前降至正常。(P＜0.05)。<