谷氨酰胺對(duì)甲氨蝶呤所致大鼠腸粘膜炎癥保護(hù)作用的研究.pdf

1、前言：
　　抗有絲分裂藥物甲氨蝶呤(methotrexate，MTX)，通過(guò)阻斷DNA和RNA的合成，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，并減緩或停止細(xì)胞增殖。由于其作用并非只針對(duì)腫瘤組織，還會(huì)誘發(fā)對(duì)快速增殖細(xì)胞，如骨髓和腸黏膜細(xì)胞的有害影響。在細(xì)胞毒性藥物治療后臨床表現(xiàn)出消化道毒性如粘膜炎，粘膜潰瘍?nèi)诤峡捎绊懻麄€(gè)消化道，導(dǎo)致如吞咽困難，嘔吐，腹瀉，體重減輕，直腸出血和感染癥狀。目前沒(méi)有有效的規(guī)范治療方法，減少口腔和胃腸道的腸黏膜炎。化療導(dǎo)致腸毒性的分

2、子機(jī)制仍不明確。因此研究進(jìn)步預(yù)防干預(yù)作用仍然是一個(gè)挑戰(zhàn)。
　　腸黏膜的機(jī)械屏障由連續(xù)的腸黏膜上皮細(xì)胞、其間的連接和黏膜的特殊結(jié)構(gòu)以及腸表面黏液層組成。腸黏膜機(jī)械屏障的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)是完整的腸上皮細(xì)胞和相鄰腸上皮細(xì)胞之間的連接，兩者共同構(gòu)成腸道的選擇性屏障，并調(diào)控著水和溶質(zhì)的跨上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)。細(xì)胞間的連接有緊密連接、黏附連接、縫隙連接和橋粒等，而緊密連接則是腸上皮細(xì)胞間主要的連接方式。
　　腸上皮還創(chuàng)建了免疫屏障調(diào)節(jié)管腔共生細(xì)菌與黏膜

3、免疫系統(tǒng)的相互作用。腸上皮細(xì)胞(intestinal epithelial cell，IEC)，尤其是小腸的潘氏細(xì)胞，產(chǎn)生和釋放抗菌因子減少細(xì)菌在腸上皮表面的定植的數(shù)量，調(diào)節(jié)腸道復(fù)雜的細(xì)菌的組成。為了其重要免疫調(diào)節(jié)功能，IEC需要檢測(cè)腸道細(xì)菌和調(diào)整他們的反應(yīng)，旨在維持自身動(dòng)態(tài)平衡。IEC表達(dá)幾種模式識(shí)別受體（pattern recognition receptors，PRRs），包括Toll樣受體(Toll-like receptors

4、，TLRs)和NOD樣受體(Nod-like receptors, NLRs)，檢測(cè)到共生的細(xì)菌。觸發(fā)這些受體誘導(dǎo)激活核因子κB(nuclear factorκB，NF-κB)等促炎途徑產(chǎn)生抗菌因子，細(xì)胞因子，趨化因子和其他分子促進(jìn)上皮細(xì)胞和腸黏膜免疫細(xì)胞之間聯(lián)系。
　　谷氨酰胺(glutamine，GLN)是血液中最豐富的氨基酸，它是主要的腸上皮細(xì)胞代謝前體。腸細(xì)胞很大程度上依賴于谷氨酰胺作為代謝前體，合成如核苷酸，氨基糖和蛋白

5、質(zhì)。它是目前應(yīng)用非常廣泛的腸黏膜保護(hù)劑，是維持腸道黏膜代謝、結(jié)構(gòu)和功能的必須營(yíng)養(yǎng)成分，對(duì)維護(hù)腸黏膜細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化和增殖具有重要的意義。本文通過(guò)研究MTX模型鼠小腸炎癥發(fā)生機(jī)制，了解谷氨酰胺是否與腸上皮細(xì)胞間緊密連接和NF-κ Bp65通路調(diào)節(jié)有關(guān)，進(jìn)一步揭示MTX誘發(fā)的腸粘膜病理狀態(tài)分子機(jī)制，以及谷氨酰胺是否對(duì)其有保護(hù)作用。
　　實(shí)驗(yàn)材料和方法
　　一、動(dòng)物模型及分組
　　10-12周SD大鼠，體重250-300g，

6、由中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。隨機(jī)分為3組。每組16只。根據(jù)腹腔注射藥物的不同將SD大鼠分為3組:CON組(control group):腹腔注射生理鹽水1ml連續(xù)2天，每日口服灌胃生理鹽水1ml。
　　MTX組:腹腔注射MTX1 ml(20mg/kg)連續(xù)2天，每日口服灌胃生理鹽水1ml。
　　GLN組:腹腔注射MTX1 ml(20mg/kg)連續(xù)2天，每日口服灌胃GLN1ml(2g/kg·d)。
　　

7、二、實(shí)驗(yàn)標(biāo)本采集及處理
　　造模后每天觀察動(dòng)物一般狀況、糞便情況及稱量體重;各組于注射MTX后第6，8天各隨機(jī)取8只鼠，10％水合氯醛0.3ml/kg腹腔注射麻醉，留取腸標(biāo)本后處死。
　　1、無(wú)菌操作下取回盲部末段回腸4cm，用冰鹽水灌注，清除小腸內(nèi)容物，分別放入4％多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋切片;2.5％戊二醛中保存，行電鏡檢測(cè)。病理組織學(xué)觀察為盲法。取0.1g腸組織加1ml PBS充分剪碎后離心，留上清用于ELISA檢測(cè)

8、。
　　2、留取腸組織2cm，以無(wú)菌生理鹽水沖洗腸腔，濾紙吸干水分，消毒錫紙、紗布包裹，標(biāo)記，放入液氮中速凍并轉(zhuǎn)-70℃深凍冰箱保存，用于Real time quantitiveRT-PCR及Western Blotting檢測(cè)。
　　三、試驗(yàn)方法及檢測(cè)指標(biāo)
　　1、動(dòng)態(tài)觀察大鼠一般狀態(tài)、體重和排便情況。
　　2、病理形態(tài)學(xué)研究
　　(1)各組動(dòng)物于各時(shí)間點(diǎn)處死后，剖開腹腔，觀察腸管顏色、有無(wú)水腫、出血、擴(kuò)

9、張、透壁潰瘍及粘連。
　　(2)光鏡觀察:小腸組織常規(guī)固定后，H-E染色，光鏡下觀察小腸組織形態(tài)學(xué)改變。
　　(3)電鏡觀察:小腸組織固定后，常規(guī)作透射電鏡觀察小腸組織超微結(jié)構(gòu)和腸絨毛的變化。
　　3、ELISA檢測(cè)腸組織白細(xì)胞介素IL-6，IL-23，IL-17含量。
　　4、免疫組化法測(cè)定ZO-1，Occludin，Claudin-1分布及表達(dá)。
　　5、實(shí)時(shí)定量PCR分析ZO-1，Occludin，C

10、laudin-1和NF-κBp65表達(dá)。
　　6、Western Blot法測(cè)定腸組織ZO-1，Occludin，Claudin-1和NF-κBp65蛋白表達(dá)。
　　四、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　計(jì)量資料結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)差((X)±S)表示，差異比較用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，組間比較采用方差分析LSD法(Least significant difference)。P＜0.05提示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

11、r>　　一、一般情況
　　MTX組大鼠在注射MTX后3天出現(xiàn)體毛凌亂，精神差，食欲下降，粘液便等癥狀，至第6天癥狀達(dá)到高峰，伴體重下降明顯平均下降8.2％，至第八天時(shí)體重逐漸恢復(fù)增加平均減少6.9％。GLN組大鼠出現(xiàn)上述癥狀時(shí)癥狀略輕，6天時(shí)體重平均減少6.2％。對(duì)照組大鼠活潑，進(jìn)食好，體重增加明顯。
　　二、光鏡下病理變化觀察
　　對(duì)照組大鼠小腸組織，粘膜腺體排列整齊，隱窩表面上皮完整，粘膜固有層有少許淋巴細(xì)胞，無(wú)明

12、顯炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。光鏡下觀察MTX給藥后第6天可見廣泛粘膜下層中性粒細(xì)胞及其它炎性細(xì)胞浸潤(rùn)水腫明顯。損傷部位四周粘膜腺體排列不齊或破壞，杯狀細(xì)胞減少甚至消失，腸壁水腫;損傷評(píng)分與對(duì)照組相比有差異（P＜0.05）。GLN組與MTX組粘膜比較損傷減輕(P＜0.05)，炎細(xì)胞浸潤(rùn)減弱，水腫減輕。MTX造模后8天，與造模后6天相比粘膜損傷多為局部改變，非透壁性的，炎細(xì)胞浸潤(rùn)程度減輕，水腫存在，杯狀細(xì)胞減少或消失，與對(duì)照組相比有顯著差異(P＜0.0

13、5)。GLN組與MTX組相比有顯著性差異（P＜0.05）。
　　三、腸組織在電鏡下變化
　　對(duì)照組腸黏膜上皮細(xì)胞表面微絨毛排列整齊，柱狀上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整;細(xì)胞質(zhì)內(nèi)細(xì)胞器豐富，結(jié)構(gòu)未見異常;細(xì)胞間連接緊密。MTX組微絨毛變細(xì)、稀疏、排列不整、呈倒伏狀，部分?jǐn)嗔选⒚撀?高爾基復(fù)合體水腫擴(kuò)張，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫張，細(xì)胞連接增寬。6天時(shí)電鏡改變最明顯。GLN組6天回腸電鏡改變:腸上皮微絨毛局部缺損，排列不夠規(guī)則，細(xì)胞器未見明顯擴(kuò)張。8天細(xì)胞損

14、傷有所恢復(fù)，細(xì)胞連接略增寬，異染色質(zhì)邊集。
　　四、ELISA檢測(cè)腸組織白細(xì)胞介素IL-6，IL-23，IL-17
　　6天時(shí)MTX組經(jīng)ELISA分析見IL-6，IL-23，IL-17表達(dá)明顯增強(qiáng)，MTX組表達(dá)明顯強(qiáng)于GLN組，差異均顯著（P＜0.05），較對(duì)照組表達(dá)明顯增加。8天時(shí)MTX組表達(dá)明顯強(qiáng)于GLN組，差異顯著(P＜0.05)。
　　五、腸組織ZO-1，Occludin和Claudin-1蛋白表達(dá)
　　

15、（一）免疫組化顯示
　　6天標(biāo)本ZO-1，Claudin-1，Occludin于MTX組、GLN組蛋白表達(dá)減少，較對(duì)照組有差異(P＜0.05)，ZO-1，Occludin在GLN組蛋白表達(dá)較MTX組增多，差異顯著(P＜0.05)。8天標(biāo)本ZO-1，Occludin，Claudin-1于MTX組蛋白表達(dá)減少較對(duì)照組有差異（P＜0.05），GLN組蛋白表達(dá)與MTX組差異顯著(P＜0.05)。
　?。ǘ￤estern Blot檢

16、測(cè)腸組織ZO-1，Occludin，Claudin-1和NF-Bp65蛋白表達(dá)
　　ZO-1，Occludin蛋白在第6天時(shí)對(duì)照組表達(dá)明顯增強(qiáng)，MTX組表達(dá)明顯弱于GLN組，差異均顯著(P＜0.05)。8天時(shí)ZO-1，Occludin，Claudin-1 MTX組和GLN組與對(duì)照組比較差異顯著(P＜0.05)，MTX組表達(dá)明顯弱于GLN組，差異顯著(P＜0.05)。
　　NF-κBp65蛋白在第6天，8天時(shí)經(jīng)WestenBi

17、ot分析見MTX組表達(dá)明顯增多，GLN組表達(dá)明顯弱于MTX組，差異均顯著(P＜0.05)。MTX組和GLN組較對(duì)照組表達(dá)均增加(P＜0.05)。
　　六、腸組織ZO-1，Occludin，Claudin-1和NF-κB p65分子生物學(xué)顯示
　　GLN組、MTX組與對(duì)照組比較ZO-1，Occludin和Claudin-1的基因表達(dá)水平均有減低，兩組變化趨勢(shì)一致;基因水平在第6天減低明顯，到第8天有所恢復(fù)，較對(duì)照組有顯著差異（

18、P＜0.05）。在第8天GLN組的基因表達(dá)均較MTX組升高，差異顯著(P＜0.05)。
　　GLN組、MTX組與對(duì)照組比較NF-Bp65的基因表達(dá)水平均有明顯升高，兩組變化趨勢(shì)一致;基因水平在第6天升高明顯，到第8天有所恢復(fù)，較對(duì)照組有顯著差異（P＜0.05）。在第6天、8天MTX組的基因表達(dá)均較GLN組升高，差異顯著(P＜0.05)。
　　結(jié)論：
　　1、GLN能減輕MTX誘導(dǎo)的大鼠腸粘膜炎癥病理?yè)p傷，并能促進(jìn)損傷的

19、修復(fù)。
　　2、針對(duì)由MTX誘導(dǎo)的大鼠腸炎模型口服GLN是一個(gè)方便而且有效的治療方法。
　　3、甲氨蝶呤誘導(dǎo)腸粘膜炎時(shí)，可以使緊密連接蛋白Occludin，Claudin-1，ZO-1表達(dá)下調(diào)。
　　4、應(yīng)用谷氨酰胺對(duì)甲氨蝶呤誘導(dǎo)腸粘膜炎有保護(hù)作用機(jī)制之一可能與Occludin，Claudin-1，ZO-1表達(dá)有關(guān)。
　　5、甲氨蝶呤誘導(dǎo)腸粘膜炎時(shí)使NF-κBp65表達(dá)上調(diào)。
　　6、應(yīng)用谷氨酰胺對(duì)甲氨蝶呤