FGF21通過(guò)鈍化內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激改善低氧肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞損傷.pdf

1、目的：
　　以人肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞(Human pulmonary artery endothelial cell, HPAECs)為研究對(duì)象，探索成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子21(Fibroblast growth factor21, FGF21)對(duì)HPAECs低氧損傷、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（Endoplasmic reticulum stress, ERS）相關(guān)凋亡途徑的影響及其可能的調(diào)控機(jī)制。
　　方法：
　　人肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞確定細(xì)胞純

2、度并傳代,隨機(jī)分為6組：常氧對(duì)照(Normoxia，N)組、低氧（Hypoxia，H）組、FGF21（F）組、Salubrinal（ERS-抑制劑，S）組、衣霉素（Tunicamycin-ERS激動(dòng)劑，T）組、衣霉素+FGF21（T+F）組。FGF21、Salubrinal及衣霉素的給藥濃度分別為800ng/ml，20ng/ml，2.5ng/ml。常氧組細(xì)胞放置于常氧培養(yǎng)箱（參數(shù)設(shè)置：37℃，5％CO2，21%O2）中培養(yǎng)，低氧組、FG

3、F21組、Salubrinal組、衣霉素組及衣霉素+FGF21組細(xì)胞放置于低氧培養(yǎng)箱（參數(shù)設(shè)置：37℃，5%CO2，5%O2，90%N2）中培養(yǎng)，均培養(yǎng)24小時(shí)。采用CCK-8染色法檢測(cè)各組HPAECs增殖情況。TUNEL法檢測(cè)各組HPAECs凋亡情況。透射電鏡觀察各組 HPAECs超微結(jié)構(gòu)的變化。Western-Blot法檢測(cè)各組HPAECs內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)記蛋白Bip及p-PERK蛋白、PERK蛋白、CHOP蛋白表達(dá)變化。Western

4、-Blot法檢測(cè)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激凋亡途徑相關(guān)蛋白 caspase-4、Bcl-2的表達(dá)變化。Transwell小室遷移法檢測(cè)各組HPAECs遷移能力。ELISA法檢測(cè)各組HPAECs細(xì)胞培養(yǎng)上清液中NO、ET-1含量。
　　結(jié)果：
　?、鸥鹘M肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖情況的差異：與常氧對(duì)照組相比，低氧組與ERS激動(dòng)劑衣霉素組 HPAECs的增殖活性均降低（P值均＜0.01）；與低氧組相比， FGF21組與ERS抑制劑-Salubrinal

5、組HPAECs的增殖活性均顯著升高（P值均＜0.01）；與單純 ERS激動(dòng)劑衣霉素組相比，同時(shí)給予 FGF21干預(yù)處理， HPAECs受損的增殖活性明顯恢復(fù)（P＜0.01）。⑵各組肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡情況的差異：與常氧對(duì)照組相比，低氧組與ERS激動(dòng)劑衣霉素組 HPAECs的凋亡細(xì)胞數(shù)均顯著升高（P值均＜0.01）；與低氧組相比，F(xiàn)GF21組與ERS抑制劑-Salubrinal組HPAECs的凋亡細(xì)胞數(shù)均顯著減少（P值均＜0.01）；與單純

6、ERS激動(dòng)劑衣霉素組相比，同時(shí)給予FGF21干預(yù)處理，HPAECs的凋亡細(xì)胞數(shù)較前者減少（P＜0.01）。⑶各組肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞電鏡超微結(jié)構(gòu)的差異：電鏡下，常氧對(duì)照組可見(jiàn)細(xì)胞表面微絨毛，細(xì)胞內(nèi)線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)；與常氧對(duì)照組相比，低氧組與ERS激動(dòng)劑衣霉素組均表現(xiàn)為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張明顯，核糖體脫落，空泡、自噬小體增多，并出現(xiàn)凋亡小體；與低氧組相比，F(xiàn)GF21組與ERS抑制劑-Salubrinal組均表現(xiàn)為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張顯著減弱，空泡、自噬小體減少；與單

7、純ERS激動(dòng)劑衣霉素組相比，同時(shí)給予FGF21干預(yù)處理，HPAECs內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張較前者減弱，但仍較明顯，空泡、自噬小體減少。⑷各組肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)記性蛋白Bip的表達(dá)差異：與常氧對(duì)照組相比，低氧組與ERS激動(dòng)劑衣霉素組的內(nèi)源性Bip蛋白的表達(dá)均顯著升高（P值均＜0.01）；與低氧組相比，F(xiàn)GF21組與ERS抑制劑-Salubrinal組的內(nèi)源性Bip蛋白表達(dá)均明顯降低（P值均＜0.01）；與單純ERS激動(dòng)劑衣霉素組相比，同時(shí)給予

8、 FGF21干預(yù)處理，內(nèi)源性 Bip蛋白表達(dá)增加程度較前者明顯降低（P＜0.01）。⑸各組肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激PERK-CHOP信號(hào)通路的檢測(cè)：與常氧對(duì)照組相比，低氧組與ERS激動(dòng)劑衣霉素組的內(nèi)源性p-PERK、CHOP蛋白的表達(dá)均顯著升高（P值均＜0.01），低氧組與衣霉素組的內(nèi)源性 PERK蛋白表達(dá)均明顯減少（P值均＜0.01）；與低氧組相比，F(xiàn)GF21組與ERS抑制劑-Salubrinal組的內(nèi)源性p-PERK、CHOP蛋白表

9、達(dá)均明顯降低（P值均＜0.01），F(xiàn)GF21組與 ERS抑制劑-Salubrinal組的內(nèi)源性 PERK蛋白表達(dá)均明顯升高（P值均＜0.01）；與單純ERS激動(dòng)劑衣霉素組相比，同時(shí)給予FGF21干預(yù)處理，內(nèi)源性p-PERK、CHOP蛋白表達(dá)增加程度較前者顯著降低（P值均＜0.01），內(nèi)源性PERK蛋白表達(dá)較前者明顯升高（P＜0.01）。⑹各組肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)凋亡蛋白caspase-4及抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)的差異：與常氧對(duì)照組

10、相比，低氧組與ERS激動(dòng)劑衣霉素組的內(nèi)源性caspase-4蛋白的表達(dá)均顯著升高（P值均＜0.01），低氧組與ERS激動(dòng)劑衣霉素組的內(nèi)源性Bcl-2蛋白表達(dá)均明顯減少（P值均＜0.01）；與低氧組相比，F(xiàn)GF21組與ERS抑制劑-Salubrinal組的內(nèi)源性 caspase-4蛋白表達(dá)均明顯降低（P值均＜0.01），F(xiàn)GF21組與ERS抑制劑-Salubrinal組的內(nèi)源性Bcl-2蛋白表達(dá)均明顯升高（P值均＜0.01）；與單純ERS

11、激動(dòng)劑衣霉素組相比，同時(shí)給予FGF21干預(yù)處理，內(nèi)源性caspase-4蛋白表達(dá)受到顯著抑制，較前者明顯降低（P＜0.01）。⑺各組肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞遷移能力的差異：與常氧對(duì)照組相比，低氧組與ERS激動(dòng)劑衣霉素組發(fā)生遷移的HPAECs數(shù)量均顯著減少（P值均＜0.01）；與低氧組相比，F(xiàn)GF21組與ERS抑制劑-Salubrinal組發(fā)生遷移的HPAECs數(shù)量均明顯增加（P值均＜0.01）；與單純ERS激動(dòng)劑衣霉素組相比，同時(shí)給予FGF21干

12、預(yù)處理， HPAECs受損的遷移能力明顯恢復(fù)（P＜0.01）。⑻各組肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)皮功能檢測(cè)：與正常對(duì)照組相比，低氧組與ERS激動(dòng)劑衣霉素組上清液中NO含量均明顯降低（P值均＜0.01），ET-1含量均顯著升高（P值均＜0.01）；與低氧組相比，F(xiàn)GF21組與ERS抑制劑-Salubrinal組上清液中NO含量均明顯升高（P值均＜0.05），ET-1含量均顯著降低（P值均＜0.01），并趨于常氧對(duì)照組；與單純 ERS激動(dòng)劑衣霉素組相比

13、，同時(shí)給予FGF21干預(yù)處理，上清液中下調(diào)的NO含量明顯升高（P＜0.01），上調(diào)的ET-1含量顯著降低（P＜0.01）。
　　結(jié)論：
　　①內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激參與了低氧誘導(dǎo)的HPAECs的凋亡及功能紊亂。②FGF21可部分通過(guò)抑制 PERK-CHOP途徑及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)凋亡蛋白 caspase-4的表達(dá)，抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激引起的肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡。③FGF21可能通過(guò)抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，緩解內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡及改善內(nèi)皮功能紊亂，從而抑制低氧性肺