NGF通過抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激促進大鼠脊髓損傷修復的機制研究.pdf

1、背景及目的:脊髓損傷(Spinal cord injury，SCI)是一種及其嚴重的神經(jīng)系統(tǒng)性損傷，會引發(fā)一系列病理生理性反應，包括缺血缺氧、脂質(zhì)過氧化、神經(jīng)元細胞凋亡等。目前很多實驗研究顯示內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路誘導的細胞凋亡，可以激活未折疊蛋白反應等信號途徑，在細胞生長、分化及凋亡中起到非常重要的作用。盡管早期的未折疊蛋白反應可以保護細胞免受錯誤折疊蛋白的毒害，但是過度及持續(xù)的激活將會導致細胞死亡。神經(jīng)生長因子(Nerve growth fac

2、tor，NGF)作為一種神經(jīng)營養(yǎng)因子具有促進神經(jīng)元生長及保護神經(jīng)元的作用。我們研究結果發(fā)現(xiàn)NGF可以促進大鼠脊髓損傷，進一步研究NGF的作用機制發(fā)現(xiàn):
　　(1) NGF可以抑制脊髓損傷引起的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的上調(diào)，減少急性損傷引起的神經(jīng)元凋亡，從而改善大鼠脊髓損傷，提高行為學能力。
　　(2) NGF抑制脊髓損傷引起的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激是通過激活PI3K/Akt和ERK1/2這兩個信號通路介導的。
　　方法及結果:
　　(1

3、)采用擠壓型方法來制作SD大鼠急性脊髓損傷動物模型，即用動脈血管夾(30g，2min)壓迫脊髓T8～10段造成中度脊髓損傷模型。36只雌性SD大鼠，隨機分為假手術組、模型組與NGF給藥組，按照不同時間點又分為1d，3d，7d，14d四組，采用BBB行為學評分、斜板實驗及腳步印跡法對其后肢運動功能進行評價。發(fā)現(xiàn)給予NGF組各個時間點的BBB評分、斜板角度及腳步印跡均優(yōu)于模型組，說明NGF能改善大鼠脊髓損傷后造成的行動能力的下降。隨后于相應

4、點處死大鼠，收集脊髓損傷節(jié)段作為組織標本分別用于石蠟包埋切片HE染色、尼氏染色、免疫組織化學、免疫熒光、Western blot以及其他指標的檢測。采用HE染色法觀察損傷脊髓細胞形態(tài)變化，結果發(fā)現(xiàn)NGF可以減少大鼠脊髓損傷造成的組織出血、核固縮等損傷。用TUNEL法檢測細胞凋亡同樣發(fā)現(xiàn)脊髓損傷組神經(jīng)元凋亡嚴重，而給予NGF組神經(jīng)元凋亡減少。用免疫組化法以及Western blot法來檢測脊髓組織中GRP78、CHOP/GADD153、C

5、aspase12的表達，結果也進一步證實了NGF對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激相關蛋白的抑制作用。在體外實驗中，我們用TG誘導PC12細胞模擬體內(nèi)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激模型，用流式細胞儀檢測細胞凋亡率，用免疫熒光法以及Western blot法檢測細胞蛋白的表達水平，發(fā)現(xiàn)TG作用后細胞凋亡率上升，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激相關蛋白CHOP，GRP78，Caspase-12上調(diào)，而給予NGF組，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激蛋白表達及細胞凋亡率均下降。
　　(2)在發(fā)現(xiàn)NGF對脊髓損傷具有修復作用

6、，對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激具有抑制作用的基礎上，為了進一步探索NGF是如何抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激而達到抑制神經(jīng)元細胞凋亡的作用的。我們結合一些文獻報道，PI3K/Akt和ERK1/2這兩個通路參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激，結合本課題實驗，我們發(fā)現(xiàn)脊髓損傷后PI3K/Akt和ERK1/2這兩個通路先被激活后被抑制。而在給予NGF的SCI的動物脊髓組織標本中發(fā)現(xiàn)PI3K/Akt和ERK1/2這兩個通路始終處于激活狀態(tài)，從而達到持續(xù)抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的作用。這一結果在體外PC12

7、細胞上得到了驗證。因此，我們引入了LY294002(PI3K/Akt抑制劑)和PD98059(ERK1/2抑制劑)來進一步證實NGF對PI3K/Akt和ERK1/2這兩個通路的上調(diào)作用。結果顯示當分別阻斷這兩個通路時，NGF對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激相關蛋白的抑制作用都被部分抑制了。流式結果也顯示，當加入抑制劑后NGF對TG造成的PC12細胞凋亡保護作用降低。
　　結論:NGF通過激活PI3K/Akt和ERK1/2兩個內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激信號通路來抑制內(nèi)