bFGF通過抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激對帕金森病保護作用的機制研究.pdf

1、本研究分為二部分：
　　第一部分：bFGF通過抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激對帕金森病模型大鼠的保護作用
　　目的:制備6-OHDA誘導的帕金森病大鼠模型。利用免疫組化檢測大鼠腦內(nèi)酪氨酸羥化酶(TH)的表達水平和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激相關(guān)蛋白(GRP78、CHOP、Caspase12)的表達水平，來初步探討6-OHDA誘導的帕金森病大鼠模型中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激(ERS)與細胞凋亡的關(guān)系，觀察bFGF對帕金森病體外模型的保護作用。
　　方法:用腦立體定位儀

2、定位到大鼠的右側(cè)紋狀體，定點注射6-OHDA制作單側(cè)PD動物模型;設置假手術(shù)組（Sham）、模型組(PD)和bFGF給藥組(PD+bFGF)，采用APO誘導旋轉(zhuǎn)，驗證模型是否成功。造模成功后尾靜脈注射bFGF，觀察它對PD大鼠行為學的影響。HE染色法觀察造模后，紋狀體的損傷情況和給藥后的形態(tài)變化;免疫組化檢測黑質(zhì)中TH含量的變化以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激相關(guān)蛋白（GRP78、CHOP、Caspase12）含量的變化。
　　結(jié)果:
　　1

3、、APO誘導旋轉(zhuǎn)實驗顯示，假手術(shù)組未發(fā)現(xiàn)旋轉(zhuǎn)。模型組平均旋轉(zhuǎn)速率為7r/min，造模成功。bFGF給藥組平均旋轉(zhuǎn)速率下降至4.31 r/min，有一定程度的下降。說明用bFGF治療后可改善大鼠的旋轉(zhuǎn)行為;
　　2、HE染色結(jié)果表明，大鼠紋狀體造模時的損傷部位細胞壞死，給予bFGF后紋狀體的形態(tài)得到了修復和改善;
　　3、免疫組化結(jié)果顯示bFGF給藥組TH的表達明顯高于模型組，但是低于假手術(shù)組;
　　4、免疫組化結(jié)果顯示

4、6-OHDA造模后，GRP78、CHOP、Caspase12蛋白表達均明顯高于假手術(shù)組，bFGF給藥后逐漸減少。
　　結(jié)論:成功建立了6-OHDA誘導的大鼠PD模型，并且bFGF在一定程度上改善了PD癥狀。同時模型組ERS相關(guān)蛋白GRP78、CHOP和Caspase12在黑質(zhì)中表達增加，bFGF給藥組表達下降。
　　第二部分：bFGF通過激活PI3K/Akt和ERK1/2信號通路抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激引起帕金森模型細胞的凋亡

5、　　目的:研究bFGF對6-OHDA誘導ERS引起的PC12細胞損傷的保護作用機制。
　　方法:
　　1、用100μM的6-OHDA作用PC12細胞24h，建立ERS介導的損傷模型，之后用20ng/ml bFGF作用24h，流式細胞儀檢測各組細胞凋亡率，western blot法檢測p-Akt， p-ERK1/2，TH以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)蛋白（GRP78、XBP-1、ATF6、CHOP和Caspase12）的表達情況。
　　

6、2、在加入bFGF保護細胞的同時，加入分別加入PI3K/Akt和ERK1/2信號通路抑制劑LY294002和U0126。共同作用24h后，流式細胞儀檢測各組細胞凋亡率，western blot法檢測p-Akt，p-ERK1/2，TH以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)蛋白(GRP78、XBP-1、ATF6、CHOP和Casp ase12)的表達情況。
　　結(jié)果:
　　1、流式結(jié)果顯示用6-OHDA誘導過的PC12細胞， bFGF給藥后，細胞凋亡率

7、明顯下降。
　　2、Western blot結(jié)果顯示，用6-OHDA誘導過的PC12細胞，p-Akt和p-ERK1/2蛋白的表達升高(p＜0.05)，TH表達明顯降低(p＜0.01)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激相關(guān)蛋白（GRP78、XBP-1、ATF6、CHOP和Caspase12）的表達明顯升高(p＜0.05);用bFGF給藥后，p-ERK1/2和p-Akt表達又開始升高(p＜0.05)，而內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)蛋白（GRP78、XBP-1、ATF6、CH

8、OP和Caspase12）的表達明顯下降(p＜0.05)。
　　3、同時加入bFGF和ERK1/2，AKT抑制劑進行干預，流式結(jié)果顯示bFGF對細胞的保護作用明顯降低，抑制劑組和bFGF給藥組比較，細胞凋亡率明顯升高。
　　4、同時加入bFGF和ERK1/2，AKT抑制劑進行干預，Western blot結(jié)果顯示，加入抑制劑的組和bFGF給藥組比較，抑制劑組的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激相關(guān)蛋白表達明顯升高(p＜0.05)，加入抑制劑后TH的