甘草miRNA對人免疫細(xì)胞基因表達(dá)譜的影響研究.pdf

1、背景及目的：前期高通量測序結(jié)果顯示，miRNA156、miRNA1511、miRNA8155在甘草水煎劑miRNA中豐度較高。本研究通過細(xì)胞形態(tài)學(xué)、細(xì)胞的增殖情況及免疫相關(guān)基因表達(dá)方面探究甘草的miRNA156、miRNA1511、miRNA8155對人免疫細(xì)胞的影響。通過表達(dá)譜測序發(fā)現(xiàn)差異基因并加以驗(yàn)證，從而為甘草藥效新機(jī)制的相關(guān)研究開拓新的思路。
　　方法：
　　1、根據(jù)高通量測序結(jié)果中的miRNA156、miRNA15

2、11、miRNA8155序列，設(shè)計(jì)合成相應(yīng)的反轉(zhuǎn)錄及檢測引物，通過RT-PCR確認(rèn)甘草組織miRNA中確實(shí)存在前期從其水煎劑中通過高通量測序技術(shù)鑒定出來的幾種microRNA分子：miRNA156、miRNA1511、miRNA8155。
　　2、使用FAM標(biāo)記的小分子DNA來驗(yàn)證脂質(zhì)體Lip2000的轉(zhuǎn)染效率以建立可靠的轉(zhuǎn)染方法；設(shè)計(jì)合成miRNA156、miRNA1511和miRNA8155相對應(yīng)的mimic；將其分別通過Li

3、p2000轉(zhuǎn)染人的免疫細(xì)胞（PBMC、CIK、Jurkat細(xì)胞系），并以無關(guān)的miRNA NC mimic作為陰性對照組；使用顯微鏡觀察并進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)來比較各組間細(xì)胞形態(tài)和細(xì)胞增殖情況；使用RT-PCR檢測各組細(xì)胞間部分免疫相關(guān)基因的表達(dá)變化情況。
　　3、將各miRNA mimic轉(zhuǎn)染健康人PBMC細(xì)胞，培養(yǎng)24小時(shí)后，提取細(xì)胞的總RNA，進(jìn)行表達(dá)譜測序，分析各組細(xì)胞基因表達(dá)的差異，并通過GO及KEGG富集分析對差異基因進(jìn)行分類

4、和注釋。
　　4、使用Real-time PCR及Western-blotting技術(shù)分別從基因水平和蛋白水平來驗(yàn)證表達(dá)譜測序結(jié)果的可靠性。
　　結(jié)果：
　　1、通過RT-PCR檢測目標(biāo)miRNA，發(fā)現(xiàn)甘草組織總RNA中確實(shí)能檢測到miRNA156、miRNA1511、miRNA8155，驗(yàn)證了前期高通量測序結(jié)果，為后續(xù)研究奠定了可靠基礎(chǔ)。
　　2、通過用Lip2000轉(zhuǎn)染FAM標(biāo)記的小分子DNA，倒置熒光顯微鏡

5、下觀察發(fā)現(xiàn)Lip2000有較高的轉(zhuǎn)染效率。制備合成了miRNA156、miRNA1511、miRNA8155相對應(yīng)的miRNA mimic，并成功通過Lip2000轉(zhuǎn)染進(jìn)人的免疫細(xì)胞（PBMC、CIK、JURKAT細(xì)胞）；實(shí)驗(yàn)組與對照組間細(xì)胞形態(tài)有明顯差異；甘草的三個(gè)miRNA對PBMC細(xì)胞和CIK細(xì)胞生長有增殖作用，而對急性T細(xì)胞白血病細(xì)胞系JURKAT的生長存在明顯抑制作用。RT-PCR結(jié)果顯示，甘草miRNA使PBMC、CIK、J

6、URKAT細(xì)胞中部分免疫相關(guān)細(xì)胞因子、信號(hào)分子和轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)水平發(fā)生了顯著的變化。
　　3、表達(dá)譜測序分析結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組與對照組比較，存在較多表達(dá)差異基因，GO及KEGG富集分析結(jié)果提示這些差異基因參與重要的免疫過程，與人的免疫功能密切相關(guān)。
　　4、Real-time PCR的驗(yàn)證結(jié)果顯示，差異基因的表達(dá)變化情況與表達(dá)譜測序結(jié)果基本一致。而Western-blotting結(jié)果顯示，部分差異基因在PBMC和CIK細(xì)胞中未檢