甘草水煎劑中miRNA的提取、高通量測序及對免疫細(xì)胞的影響研究.pdf

1、目的：
　　本研究首先對經(jīng)過傳統(tǒng)高溫水煎方法得到的甘草浸膏中是否含有miRNA進(jìn)行鑒定，然后通過高通量測序進(jìn)行進(jìn)一步的驗證，以證明甘草中是否存在穩(wěn)定性很高的miRNA，同時也表明其中是否含有豐富的miRNA。如果確認(rèn)得到甘草miRNA，則將其作用于從健康人外周血中分離出的外周血單核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cells,PBMC），從細(xì)胞形態(tài)學(xué)的變化，細(xì)胞計數(shù)鑒定細(xì)胞的增殖情況，流式檢測細(xì)胞表型

2、變化，免疫相關(guān)基因表達(dá)等幾方面，初步探究甘草miRNA對免疫細(xì)胞的影響。
　　方法：
　　一、對甘草的水煎劑經(jīng)過高溫處理后又經(jīng)高溫蒸煮和冷凍干燥處理，通過通用植物microRNA快速提取試劑盒進(jìn)行小分子RNAD提取，然后電泳檢測是否提取到甘草miRNA，經(jīng)過DnaseⅠ消化后，對其濃度和純度進(jìn)行檢測。
　　二、利用HiSeq高通量測序技術(shù)，對甘草miRNA進(jìn)行測序分析，并預(yù)測其中是否存在新的miRNA。即原始數(shù)據(jù)統(tǒng)計處

3、理后得到的干凈Clean序列進(jìn)行比對、堿基偏向性分析和小RNA分類注釋后，再將沒能比對上又沒有注釋到數(shù)據(jù)庫中的小RNA進(jìn)行新miRNA的預(yù)測。
　　三、將所得到的甘草miRNA靶向人類基因進(jìn)行比對分析，初步篩選得到甘草miRNA調(diào)控的候選人類靶基因，并運用GO分析對這些靶基因的功能進(jìn)行分類和注釋。
　　四、利用所提取的甘草miRNA作用于從健康人外周血中分離出的外周血單核細(xì)胞，細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察和計數(shù)后，流式檢測細(xì)胞表型的變化。

4、利用RT-PCR對部分細(xì)胞因子、信號分子和轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)變化進(jìn)行分析，初步探索甘草miRNA對人免疫細(xì)胞的影響。
　　結(jié)果：
　　一、經(jīng)過炮制的甘草干燥藥材，經(jīng)過高溫熬煮，所得水提物又經(jīng)高溫蒸煮和冷凍干燥，從得到的甘草浸膏凍干物中有效地提取到了miRNA，表明植物miRNA的結(jié)構(gòu)非常穩(wěn)定不易被破壞，同時也為中藥miRNA能夠經(jīng)消化道進(jìn)入人體提供了佐證。
　　二、對得到的甘草miRNA的測序，根據(jù)測序結(jié)果分析其中得到已知

5、的miRNA并預(yù)測新的miRNA。測序結(jié)果中有個重要的發(fā)現(xiàn)就是，干凈序列(clean序列)經(jīng)比對分析發(fā)現(xiàn)甘草中含有310個miRNA家族。這在目前的miRNA的研究領(lǐng)域是不常見的，因為模式生物擬南芥也僅發(fā)現(xiàn)529個miRNA家族。另一個發(fā)現(xiàn)是預(yù)測到7個新miRNA。
　　三、經(jīng)過靶基因預(yù)測，發(fā)現(xiàn)甘草中的部分miRNA對人類基因高度匹配。如MIR155、MIR5303、MIR8016這三個miRNA分別與IL-6、STAT1、BCL

6、-2相匹配。被預(yù)測到的靶基因中與免疫系統(tǒng)相關(guān)基因數(shù)量龐大，將近1100個左右。這些結(jié)果從一定程度說明甘草miRNA可能對人的免疫功能有影響。這使得在理論上miRNA進(jìn)行跨物種調(diào)控成為一種可能。
　　四、甘草miRNA不僅能夠增強PBMC的增殖能力，還能夠增強免疫細(xì)胞的抗原提呈能力，流式分析表明，經(jīng)過miRNA處理的PBMC中HLA-DR+細(xì)胞發(fā)生了非常顯著的增殖，而HLA-DR+細(xì)胞的增加意味著抗原提成能力的增強。這可能部分解釋了

7、甘草miRNA具有調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能的作用。RT-PC結(jié)果表明，甘草miRNA對信號分子和轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)引起明顯的變化，而信號分子和轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)的變化會引起信號通路的激活或被抑制。這可能能夠進(jìn)一步解釋其具有免疫調(diào)節(jié)功能。
　　結(jié)論：
　　甘草干燥藥材水提物中miRNA的存在，以及甘草miRNA對人免疫細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用的發(fā)現(xiàn)，為我們提供了認(rèn)識和研究甘草的一個新途徑。進(jìn)一步研究其miRNA的功用，將對甘草的作用機(jī)制研究和臨床應(yīng)用乃至