peasyt1載體

1、pEASYT1CloningKit目錄號：目錄號：CT101CT101試劑試劑盒組成1.pEASYT1CloningVect(10ngμl)2.ControlTemplate(5ngμl)ControlPrimers(10μM)3.M13F(10μM)，M13R(10μM)4.Trans1T1PhageResistantChemicallyCompetentCell.保存保存Trans1T1PhageResistantChemicall

2、yCompetentcell可于–70℃保存至少六個月其他組分20℃保存至少六個月。產(chǎn)品說明pEASYT1CloningKits適用于TA克隆.快速克隆基因，僅需要5分鐘反應(yīng)時間。提供氨芐青霉素和卡那霉素兩種篩選標(biāo)記。對照插入片段克隆效率可達(dá)95%以上。包含LacZ基因，在含有IPTG，Xgal的平板培養(yǎng)基上，可進(jìn)行藍(lán)白斑篩選。工作原理工作原理pEASYT1CloningKits以線性的形式提供:3′端懸垂胸腺嘧啶(T)可用于TA克隆拓

3、撲異構(gòu)酶與載體相互偶聯(lián)（活化載體）TaqDNA聚合酶具有類似脫氧核糖核酸末端轉(zhuǎn)移酶(TdT)的功能，可在新合成雙鏈產(chǎn)物的3’端加上一個堿基。盡管4種堿基均可被聚合到3’端，但Taq酶對dATP的聚合能力遠(yuǎn)高于其他3種dNTP.所以，在標(biāo)準(zhǔn)PCR條件下，1.輕輕混合，室溫(20℃37℃)反應(yīng)5分鐘。反應(yīng)結(jié)束后，將離心管置于冰上。2.轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞。注意！注意！1.如不進(jìn)行后期轉(zhuǎn)化試驗，連接體系可以儲存于20℃。2.推薦使用1μL載體3.最

4、佳載體與片段摩爾比為1：7（在載體為1μL的情況下，可以粗略的按照“1Kb長度的片段需加入20ng的比例計算。如1Kb加入片段20ng、1.5Kb加30ng等）4.推薦使用35μL的反應(yīng)體系。5.最佳反應(yīng)時間①片段大小為0.11Kb（含1Kb）：510min②片段大小為12Kb（含2Kb）：1015min③片段大小為23Kb（含3Kb）：1520min片段為膠回收產(chǎn)物，反應(yīng)時間取最大值。延長連接時間可以使克隆數(shù)目有所增長，但反應(yīng)時間不能

5、多于30min。6.最佳反應(yīng)溫度：25℃，若片段是高GC結(jié)構(gòu)，可以37℃反應(yīng)。（推薦用PCR儀控溫）轉(zhuǎn)化Trans1T1CompetentCells1.加連接產(chǎn)物于50μlTrans1T1感受態(tài)細(xì)胞中（在感受態(tài)細(xì)胞剛剛解凍時加入連接產(chǎn)物），輕彈混勻，冰浴2030分鐘。2.42℃熱激30秒，立即置于冰上2分鐘。3.加250μl平衡至室溫的SOCLB，200轉(zhuǎn)，37℃孵育1小時。4.取8μl，500mMIPTG，40μl，20mgmlXga