質(zhì)粒載體介紹

1、質(zhì)粒載體介紹（質(zhì)?；咎匦院头N類及標記基因）一、質(zhì)粒的基本特性一、質(zhì)粒的基本特性1質(zhì)粒的復制通常一個質(zhì)粒含有一個與相應的順式作用控制要素結(jié)合在一起的復制起始區(qū)（整個遺傳單位定義為復制子）。在不同的質(zhì)粒中，復制起始區(qū)的組成方式是不同的，有的可決定復制的方式，如滾環(huán)復制和θ復制。在大腸桿菌中使用的大多數(shù)載體都帶有一個來源于pMB1質(zhì)?；駽olE1質(zhì)粒的復制起始位點。圖31是其復制其始示意圖。在復制時，首先合成前RNAⅡ，即前引物，并與DNA

2、形成雜交體；而后RNaseH切割前RNAⅡ，使之成為成熟的RNAⅡ，并形成三葉草二級結(jié)構(gòu)，該引物引導質(zhì)粒的復制。形成的RNAⅠ可控制RNAⅡ形成二級結(jié)構(gòu)，同時Rop增強RNAⅠ的作用，從而控制質(zhì)粒的拷貝數(shù)。削弱RNAⅠ和RNAⅡ之間相互作用的突變，將增加帶有pMB1或（ColE1）復制子的拷貝數(shù)。圖31帶pMB1（或ColE1）復制起點的質(zhì)粒在復制起始階段所產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄的方向及其粗略大小。2質(zhì)粒的拷貝數(shù)質(zhì)?？截悢?shù)分為嚴謹型與松馳型。嚴謹型

3、質(zhì)粒每個細胞中拷貝數(shù)有限，大約1～幾個；松馳型質(zhì)?？截悢?shù)較多，可達幾百。表51就是不同類的質(zhì)粒與復制子及拷貝數(shù)的大致關系。表3131：質(zhì)粒載體及其拷貝數(shù)：質(zhì)粒載體及其拷貝數(shù)質(zhì)粒質(zhì)粒復制子復制子拷貝數(shù)拷貝數(shù)pBR322及其衍生質(zhì)粒pMB115～20pUC系列質(zhì)粒及其衍生質(zhì)粒突變的pMB1500～700pACYC及其衍生質(zhì)粒p15A10～212pSC101及其衍生質(zhì)粒pSC101～5ColE1ColE115～20pUC系列質(zhì)粒的復制單位來自

4、質(zhì)粒pMB1，但其拷貝數(shù)較高。pMB1質(zhì)粒的復制并不需要質(zhì)粒編碼的功能蛋白，而是完全依靠宿主提供的半衰期較長的酶（DNA聚合酶Ⅰ，DNA聚合酶Ⅲ），依賴于DNA的RNA聚合酶，以及宿主基因dnaB、dnaC、dnaD和danZ的產(chǎn)物。因此，存在抑制蛋白質(zhì)合成并阻斷細菌染色體復制的氯霉素或壯觀霉素等抗生素時，帶有pMB1（或ColE1）復制子的質(zhì)粒將繼續(xù)復制，最后每個細胞中可積聚2～3千個質(zhì)粒。3質(zhì)粒的不相容性兩個質(zhì)粒在同一宿主中不能共存

5、的現(xiàn)象稱質(zhì)粒的不相容性，它是指在第二個質(zhì)粒導入后，在不涉及DNA限制系統(tǒng)時出現(xiàn)的現(xiàn)象。不相容的質(zhì)粒一般都利用同一復制系統(tǒng)，從而導致不能共存于同一宿主中。兩個不相容性質(zhì)粒在同一個細胞中復制時，在分配到子細胞的過程中會競爭，隨機挑選，微小的差異最終被放大，從而導致在子細胞中只含有其中一種質(zhì)粒。而不相容群指那些具有不相容性的質(zhì)粒組成的一個群體，一般具有相同的復制子。在大腸桿菌中現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)30多個不相容群，如ColE1和pMB1，pSC101和p

6、15A。4轉(zhuǎn)移性質(zhì)粒具轉(zhuǎn)移性。它是指在自然條件下，很多質(zhì)?？梢酝ㄟ^稱為細菌接合的作用轉(zhuǎn)移到新宿主內(nèi)。它需要移動基因mob，轉(zhuǎn)移基因tra，順式因子bom及其內(nèi)部的轉(zhuǎn)移缺口位點nic。二、標記基因二、標記基因按其用途可將標記基因分為選擇標記基因和篩選標記基因。選擇標記用于鑒別目標DNA（載體）的存在，將成功轉(zhuǎn)化了載體的宿主挑選出來，篩選標記可用于將特殊表型的重組子挑選出來。用的底物。異丙基βD硫代半乳糖苷（IPTG）是乳糖的衍生物，可作為

7、lac操縱子的誘導物，但不能作為反應的底物；5溴4氯3吲哚βD半乳糖苷（Xgal）可作為lac操縱子的底物，但不能作為誘導物。底物Xgal還可充作生色劑，被β半乳糖苷酶分解后可產(chǎn)生蘭色產(chǎn)物，可使菌落或噬菌斑呈蘭色。2插入失活通過插入失活進行篩選的質(zhì)粒主要有pBR322，該質(zhì)粒具有四環(huán)素抗性基因（tetr）和氨芐青霉素抗性基因（ampr）兩種抗性標記。當外源DNA片段插入tetr基因后，導致tetr基因失活，變成只對氨芐青霉素有抗性。這樣

8、就可通過對抗生素是雙抗還是單抗來篩選是否有外源片段插入到載體中。三、質(zhì)粒載體的種類三、質(zhì)粒載體的種類（一）克隆載體克隆載體主要用于擴增或保存DNA片段，是最簡單的載體。1pBR322pBR322質(zhì)粒的大小為4361bp，GenBank注冊號為V0lll9和J01749，含有30多個單一位點，具有四環(huán)素抗性基因（tetr）和氨芐青霉素抗性基因（ampr），其質(zhì)粒復制區(qū)來自pMB1（如圖33）。目前使用廣泛的多質(zhì)粒載體幾乎都是由此發(fā)展而來的

9、。利用四環(huán)素抗性基因內(nèi)部的BamHⅠ位點來插入外源DNA片段，可通過插入失活進行篩選。2pUC18和pUC19pUC18和pUC19大小只有2686bp，是最常用的質(zhì)粒載體，其結(jié)構(gòu)組成緊湊，幾乎不含多余的DNA片段，GenBank注冊號為L08752（pUC18）和X02514（pUC19）。由pBR322改造而來，其中l(wèi)acZ（MSC）來自M13mp1819圖34是其質(zhì)粒圖譜。這兩個質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)幾乎是完全一樣的，只是多克隆位點的排列方向