質(zhì)粒提取

1、質(zhì)粒DNA提取1.質(zhì)粒提取中各步離心時(shí)離心力怎么確定？離心時(shí)一般都用12000rpmmin；也有一些方法是采用10000rpmmin，對(duì)質(zhì)粒的影響不大。但在提取大分子量質(zhì)粒時(shí)，要特別注意離心的速度，速度過高會(huì)使質(zhì)粒斷裂。2.簡介：葡萄糖：使懸浮后的大腸桿菌不會(huì)快速沉積到管子的底部（可缺）EDTA：Ca2和Mg2等二價(jià)金屬離子的螯合劑，配在分子生物學(xué)試劑中的主要作用是：抑制DNase的活性，和抑制微生物生長。在溶液I中加入高達(dá)10mM的E

2、DTA，無非就是要把大腸桿菌細(xì)胞中的所有二價(jià)金屬離子都螯合掉。溶液I：可用等體積的水，或LB培養(yǎng)基代替NaOH：是最佳的溶解細(xì)胞的試劑，不管是大腸桿菌還是哺乳動(dòng)物細(xì)胞，碰到了堿都會(huì)幾乎在瞬間就溶解，這是由于細(xì)胞膜發(fā)生了從bilayer（雙層膜）結(jié)構(gòu)向micelle（微囊）結(jié)構(gòu)的相變化所導(dǎo)致。SDS：十二烷基硫酸鈉（sodiumdodecylsulfate）遇到鉀離子后變成了十二烷基硫酸鉀（potassiumdodecylsulfate，

3、PDS），而PDS是水不溶的，因此發(fā)生了沉淀。鉀離子置貝數(shù)或宿主菌具有很高的生長率，則需減少LB培養(yǎng)液體積。7、質(zhì)粒未全部溶解(尤其質(zhì)粒較大時(shí))：洗脫溶解質(zhì)粒時(shí)，可適當(dāng)加溫或延長溶解時(shí)間。8、乙醇?xì)埩簦浩匆合礈旌髴?yīng)離心盡量去除殘留液體，再加入洗脫緩沖液。9、洗脫液加入位置不正確：洗脫液應(yīng)加在硅膠膜中心部位以確保洗脫液會(huì)完全覆蓋硅膠膜的表面達(dá)到最大洗脫效率。10、洗脫液不合適：DNA只在低鹽溶液中才能被洗脫，如洗脫緩沖液EB(10mMT

4、risHCl1mMEDTA，pH8.5)或水。洗脫效率還取決于pH值，最大洗脫效率在pH7.08.5間。當(dāng)用水洗脫時(shí)確保其pH值在此范圍內(nèi)，如果pH過低可能導(dǎo)致洗脫量低。洗脫時(shí)將滅菌蒸餾水或洗脫緩沖液加熱至60℃后使用，有利于提高洗脫效率。11、洗脫體積太?。合疵擉w積對(duì)回收率有一定影響。隨著洗脫體積的增大回收率增高，但產(chǎn)品濃度降低。為了得到較高的回收率可以增大洗脫體積。12、洗脫時(shí)間過短：洗脫時(shí)間對(duì)回收率也會(huì)有一定影響。洗脫時(shí)放置1mi

5、n可達(dá)到較好的效果9.細(xì)菌離心加入溶液I蝸旋振蕩后，發(fā)現(xiàn)菌體呈絮狀不均勻或呈細(xì)砂狀？參考見解：1、很可能是細(xì)菌發(fā)生溶菌，可減少培養(yǎng)時(shí)間或者試試平板培養(yǎng)，質(zhì)粒提取前用PBS將菌落洗下，相較來說固體培養(yǎng)基上細(xì)菌生長的要好一些。2、質(zhì)粒抽提過程很大程度上是受細(xì)菌生長情況決定的，剛活化的菌比負(fù)80℃保存菌種所培養(yǎng)出來的菌液狀態(tài)好，保存久的菌株可能會(huì)造成質(zhì)粒濃度低，質(zhì)粒丟失等不明原因。3、判斷生長的菌液是否正常，可以用肉眼觀察，在光線明亮處搖蕩新

6、鮮培養(yǎng)液，如果發(fā)現(xiàn)菌液呈漂絮狀，情況很好。如果發(fā)現(xiàn)呈泥水狀，即看不到絮狀，只是感覺很渾濁，則可能提不出好的質(zhì)粒，或者沒有質(zhì)粒。4、菌液不宜生長太濃，搖床速度不宜過高。10.為什么加了溶液Ⅱ后，菌體沒有逐漸由混濁變澄清？提出來的條帶幾乎沒有，但是RNA很亮（沒加RNA酶）？參考見解：溶液Ⅱ主要就是NaOH，如果菌液沒有由混濁變澄清。1、可能是因?yàn)槿芤簝?chǔ)存不當(dāng)，或?qū)掖尾僮鳑]有及時(shí)蓋好溶液瓶蓋，導(dǎo)致其吸收空氣中的CO2失效。RNA在菌體中量較

7、多，相對(duì)少量的菌體裂解，可有較DNA明顯的條帶。2、可能是菌量大，加溶液Ⅱ后，菌體并不能完全裂解，所以沒有變清，這也會(huì)導(dǎo)致質(zhì)粒產(chǎn)率低下3、可能是質(zhì)粒的拷貝數(shù)不高，質(zhì)粒產(chǎn)率不高如果是使用自己配的試劑，建議做中提或大提；或者買試劑盒提用自己配的試劑，不加RNA酶，最后RNA是很亮的，要去除干凈就要用比較好的ＲＮＡ酶。4、如果不是試劑的原因，可能是質(zhì)粒表達(dá)的過程中使膜蛋白變化（數(shù)量變多），很難使用堿裂解法，可以嘗試用其他比較劇烈的方法(比如高

8、溫或者低溫研磨等)然后使用一般的發(fā)放。5、可能質(zhì)粒隨乙醇一起倒掉了。11.加入溶液II后，菌液仍然呈渾濁狀態(tài)，或者混濁度沒有明顯的改變？裂解不完全參考見解：1、問題可能是發(fā)生在溶液II上。首先看看10％SDS是否是澄清的？NaOH是否是有效的？如果使用的是試劑盒，也要首先確認(rèn)溶液II是否澄清沒有沉淀？2、可能是細(xì)菌濃度很高，適當(dāng)調(diào)整增加溶液IIIIII的體積。3、可能是“雜菌”污染，如果菌液生長異?？?，就有可能被雜菌污染。這種情況一般表