柱離心法純化質(zhì)粒dna

1、柱離心法純化質(zhì)粒柱離心法純化質(zhì)粒DNA一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康囊?、?shí)驗(yàn)?zāi)康膶W(xué)習(xí)柱離心法純化質(zhì)粒DNA二、實(shí)驗(yàn)原理二、實(shí)驗(yàn)原理離心柱結(jié)構(gòu)：特殊硅基質(zhì)吸附材料，特異性吸附DNA，而RNA與蛋白質(zhì)穿過(guò)。在正常情況下，核酸表面覆蓋了一層由水分子組成的親水薄膜，以維持其水溶性。高濃度鹽離子的加入破壞了核酸表面親水薄膜的相對(duì)有序排列，形成了疏水環(huán)境。在此環(huán)境中，核酸與硅膠膜能有效結(jié)合，而蛋白質(zhì)、代謝產(chǎn)物和其他污染物則不能結(jié)合。堿變性抽提的原理是在pH高于12.

2、6的堿性條件下，染色體DNA的氫鍵斷裂，破壞了堿基配對(duì)，導(dǎo)致雙螺旋結(jié)構(gòu)解開(kāi)而變性，但閉環(huán)的質(zhì)粒DNA鏈由于處于拓?fù)淅p繞狀態(tài)而不能彼此分開(kāi)。當(dāng)pH調(diào)至中性時(shí)，質(zhì)粒DNA鏈迅速恢復(fù)到原來(lái)構(gòu)型，仍保存于溶液中。而變性的染色體DNA不能再?gòu)?fù)性，通過(guò)離心，隨不穩(wěn)定的大分子RNA、蛋白質(zhì)SDS復(fù)合物等一起沉淀下來(lái)，使兩者得以分離。三、實(shí)驗(yàn)器材與試劑三、實(shí)驗(yàn)器材與試劑試劑盒自帶溶液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ漂洗液、結(jié)合緩沖液、洗脫緩沖液、TEbuffer器材：吸附柱

3、、取液槍、離心機(jī)、低壓電泳儀、水平電泳槽、紫外透射儀四、實(shí)驗(yàn)步驟四、實(shí)驗(yàn)步驟1.培養(yǎng)細(xì)菌：將帶有質(zhì)粒的大腸桿菌接種到1.53ml含有相應(yīng)抗生素的液體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)12～16小時(shí)由近到遠(yuǎn)各條帶分別顯示：環(huán)狀DNA、線性DNA、超螺旋DNA、RNA但是DNA各條帶顯示并不十分清晰，也不是全部都可以看到，這可能與加樣時(shí)的操作未能使得所有樣都進(jìn)入溝槽中有關(guān)。注：用柱離心法純化的質(zhì)粒DNA沒(méi)有RNA的顯示原因分析：特殊硅基質(zhì)吸附材料可以特異地

4、吸附DNA，RNA則會(huì)穿過(guò)，被基本去除，而實(shí)驗(yàn)一的離心法在吸取水層時(shí)或多或少會(huì)吸取到下面的有機(jī)層，使得最后得到的物質(zhì)中有RNA的存在。六、實(shí)驗(yàn)討論分離純化質(zhì)粒DNA的方法很多，通常是利用它與細(xì)菌染色體DNA在特性和構(gòu)型上的不同而進(jìn)行的。目前常用的有堿變性法、煮沸裂解法、羥基磷灰石柱層析法、酸酚法、兩相法以及氯化艷溴化乙錠密度梯度離心法。這些方法各有特點(diǎn)，但它們都含有以下三個(gè)基本步驟，即：①培養(yǎng)菌體和擴(kuò)增質(zhì)粒；②收獲和裂解菌體；③純化質(zhì)粒