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文檔簡介
1、I逆境脅迫因子主要有干旱、鹽漬、低溫、水澇等,是限制植物生長和區(qū)域分布以及影響農(nóng)作物產(chǎn)量和質(zhì)量的重要因素。植物對這些逆境脅迫的適應(yīng)主要被轉(zhuǎn)錄因子和調(diào)節(jié)基因(諸如控制多重抵御的酶、蛋白等)所介導(dǎo)?,F(xiàn)有研究證明,與轉(zhuǎn)錄因子活力有關(guān)聯(lián)的是轉(zhuǎn)錄輔激活子,它能增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄因子和順式作用元件的結(jié)合。MBF1是一個轉(zhuǎn)錄輔激活子,通過一個激活物和一個TATA盒結(jié)合蛋白的橋連作用來調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄激活。MBF1基因最早是在蠶、果蠅等動物體中被發(fā)現(xiàn),后來在植物中也發(fā)現(xiàn)
2、了MBF1基因。據(jù)報道,在擬南芥中的MBF1基因的超表達(dá)能增強(qiáng)其抵抗逆境脅迫的能力,而在番茄中關(guān)于此基因還沒有相關(guān)的報道,本論文擬通過在番茄中超表達(dá)MBF1基因研究其對逆境脅迫的抗性能力,從而明確MBF1基因的分子作用機(jī)制,主要研究內(nèi)容及結(jié)果如下:1.番茄MBF1基因的克隆以AC番茄果實(shí)的總RNA為模板,體外反轉(zhuǎn)錄合成cDNA,以cDNA為模板,通過PCR擴(kuò)增得到得632bp大小的片段,將其命名為LeMBF1,并登錄NCBIGenBan
3、k,登錄號為EF051474。將其與擬南芥中的MBF1基因進(jìn)行同源性比較,在DNA水平上的序列相似性為56%,在氨基酸水平上的序列相似性為82%,是一個新基因。2.Nthern雜交技術(shù)分析番茄LeMBF1基因的表達(dá)特性克隆番茄MBF1(LeMBF1)基因特異片段,以此作為探針通過Nthern雜交技術(shù)分析LeMBF1基因的表達(dá)特性,結(jié)果顯示LeMBF1基因的表達(dá)能被高溫、干旱誘導(dǎo),被復(fù)水所抑制;傷害處理能誘導(dǎo)WT番茄葉片中該基因的表達(dá),對
4、Nr番茄葉片中該基因的表達(dá)基本無影響,抑制rin番茄葉片中該基因的表達(dá);外源乙烯處理綠熟期果實(shí),LeMBF1基因的表達(dá)變化不明顯,說明在這一時期外源乙烯并不誘導(dǎo)LeMBF1基因的表達(dá)。3.雙元超表達(dá)載體pBIN19MBF1的構(gòu)建驗證的LeMBF1基因與經(jīng)PstI酶切的pDH51載體通過T4DNA連接酶連接,連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)經(jīng)PCR以及酶切鑒定確為重組中間載體質(zhì)粒,且外源片段方向正確,命名為pDH51MBF1。中間載體pDH51MBF1經(jīng)EcI
5、酶切獲得了包含35S啟動子、MBF1基因、35S終止子的片段,此片段與經(jīng)EcI酶切的pBIN19載體連接,連接產(chǎn)物經(jīng)PCR及酶切鑒定確為重組植物雙元表達(dá)載體質(zhì)粒,命名為pBIN19MBF1。4.再生番茄植株的獲得以AC++番茄子葉為外植體,通過農(nóng)桿菌LBA4404介導(dǎo),將CaMV35S啟動子調(diào)控下的MBF1基因轉(zhuǎn)入番茄,經(jīng)過50mgLKan及500mgL的Sm篩選,獲得一部分生根的再生植株。VIIIABAAbscisicacid脫落酸A
6、mpAmpicillin氨芐青霉素ATPAdenosinetriphosphate三磷酸腺苷BTMBasaltranscriptionalmachinery基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄機(jī)器bZIPafamilyoftranionfactwithbasicregionLeuzippermotif帶有堿性區(qū)域和亮氨酸拉鏈的轉(zhuǎn)錄因子家族因子具有組蛋白乙?;饔?。另外,CPBP300復(fù)合物能同RNA聚合酶Ⅱ結(jié)合同其它具有乙?;妮o助因子共同形成的復(fù)合物調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)
7、錄[31]。CBPP300不僅能同CJun、CFos、CMyb、CMyb、Sap1a、Eik1、Spebp和NFKB等特殊因子結(jié)合,而且能同諸如SRC21、PCAF、PIC等輔助激活因子結(jié)合而產(chǎn)生生物學(xué)效應(yīng)[32]。另外,通過與其它輔因子和通用轉(zhuǎn)錄因子(GTF)作用,CBPp300可以作為轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物組裝的支架和橋梁[33]。有研究還表明CBPP300除了具有轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子的作用外,還具有使組蛋白乙?;淖饔媒M蛋白乙?;蟠龠M(jìn)基因的轉(zhuǎn)錄。
8、②輔激活蛋白組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶活性染色質(zhì)轉(zhuǎn)錄先需要進(jìn)行“活化”,除了染色質(zhì)重塑以外,還將發(fā)生核小體核心組蛋白的乙?;?,即組蛋白Lys殘基上氨基的乙酰化,它使相鄰的核小體聚合受阻,并影響泛素與組蛋白H2A分子的結(jié)合?,F(xiàn)發(fā)現(xiàn)許多核受體輔激活蛋白包括P300、CBP和CBPP300相關(guān)因子(PCAF)均含有HAT活性,表明核受體可部分通過募集這些蛋白,對靶啟動子處的核小體修飾而發(fā)揮激活轉(zhuǎn)錄的作用,使組蛋白發(fā)生乙?;?,以利于基因表達(dá)。目前尚不十分
9、清楚如此之多的HAT如何調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄,但有研究表明,不同的轉(zhuǎn)錄因子對特定HAT的需要具有選擇性。核受體需要PCAF而非CBP的HAT活性,CREB和STAT21轉(zhuǎn)錄功能需要CBP而非PCAF的HAT活性,至少部分解釋了復(fù)合體中多種HAT存在的原因。③具有Arg甲基轉(zhuǎn)移酶活性的輔激活因子研究表明,組蛋白的甲基化在促進(jìn)或抑制基因表達(dá)方面也有重要作用。已知NR能以配體依賴性的方式通過p160家族成員募集精氨酸特異的甲基轉(zhuǎn)移酶,包括共激活因子
10、連接的精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶1(coactivatassociatedargentinemethyltransferase1CARM1)和蛋白精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶1(proteinargentinemethyltransferase1PRMT1)。它們能與p160家族成員C端的AD2區(qū)結(jié)合,使組蛋白H3或H4的特定部位的精氨酸甲基化,與乙酰化作用協(xié)同幫助染色體重構(gòu)或激活轉(zhuǎn)錄[3435]。兩者的同源性雖然很高,但是其底物不盡相同,兩者都可甲基化H2
11、A,但CARM1特異甲基化H3,而PRMT1甲基化H4,因而這兩者的功能不完全相同,不過其輔激活因子活性相互協(xié)同。④其它的輔激活因子復(fù)合物除了上述的幾種復(fù)合物外,人們又發(fā)現(xiàn)了另外的輔激活因子復(fù)合物,這類輔激活蛋白不同于以上的輔激活蛋白,且有功能的特異性其成員隨著研究的深入在7不斷的增加,最典型的是TRAPDRIPARC,它由一個220kD的分子介導(dǎo)結(jié)合NR,可能起招募RNA聚合酶全酶的作用。另外人們還發(fā)現(xiàn)了一個具有輔激活因子功能的RNA
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