產(chǎn)乙醇桿菌屬功能基因克隆表達及基因敲除載體構(gòu)建.pdf

1、有機廢水發(fā)酵法生物制氫技術(shù)具有能源和環(huán)保的雙重功效，已經(jīng)成為環(huán)境生物技術(shù)和新能源領(lǐng)域研究的熱點之一。但是該技術(shù)目前還處于研發(fā)階段，如何提高厭氧發(fā)酵產(chǎn)氫細菌的產(chǎn)氫能力已成為實現(xiàn)該技術(shù)工業(yè)化進程中所面臨的關(guān)鍵性問題。針對這一關(guān)鍵性問題，依據(jù)現(xiàn)有的生物產(chǎn)氫代謝理論和代謝工程調(diào)控理論，通過對現(xiàn)有高效產(chǎn)氫菌進行代謝工程改造，構(gòu)建更高效的產(chǎn)氫基因工程菌，成為實現(xiàn)其產(chǎn)業(yè)化非常有潛力的策略之一。本論文以乙醇發(fā)酵高效產(chǎn)氫菌Ethanoligenensha

2、rbinenseB49為出發(fā)菌株，克隆、表達與產(chǎn)氫相關(guān)的、控制末端代謝產(chǎn)物生成的關(guān)鍵酶基因，如對丙酮酸產(chǎn)氫途徑和NADH產(chǎn)氫途徑有影響的L-乳酸脫氫酶基因，對NADH產(chǎn)氫途徑有影響的乙醛乙醇脫氫酶基因和乙醇脫氫酶基因，對反應(yīng)中酸堿度有影響的乙酸激酶基因。并分別構(gòu)建了用于基因敲除目的的置換型基因敲除載體。本項研究克隆了涉及乙醇發(fā)酵和產(chǎn)氫發(fā)酵的重要基因，并構(gòu)建了相應(yīng)的基因敲除載體，這些資源的獲得將在揭示乙醇發(fā)酵機理、乙醇發(fā)酵產(chǎn)氫機理、等方面

3、有重要意義，也是系統(tǒng)、多方位地研究發(fā)酵法生物制氫菌種代謝工程研究的開始。
　　利用簡并引物PCR和cassettePCR技術(shù)相結(jié)合的方法克隆了控制丙酮酸生成乳酸的L-乳酸脫氫酶基因（L-ldh）的完整DNA序列。L-ldh片段DNA長2490bp，其在GenBank上的注冊號為DQ179104。編碼區(qū)DNA長951bp，編碼316aa，編碼蛋白的分子量為34.23kD，理論等電點為6.09。SignalP預(yù)測表明L-ldh氨基酸序

4、列的N端21個氨基酸為信號肽，說明L-ldh可能為分泌型酶。同時，將克隆得到的L-ldh基因在E.coli中異源表達。以獲得的序列為基礎(chǔ)，采用pET-22b和pJIR751質(zhì)粒構(gòu)建了以卡那霉素抗性基因為報告基因的L-ldh置換型基因敲除載體，其中長臂長1400bp，短臂長650bp。
　　利用簡并引物PCR和CassettePCR技術(shù)相結(jié)合的方法克隆了控制乙酰輔酶A生成乙酸的乙酸激酶基因（ack）的完整DNA序列。Ack片段DNA

5、長2980bp，其在GenBank上的注冊號為DQ179102。編碼區(qū)DNA長1200bp，編碼399aa，編碼蛋白的分子量為43.22kD，理論等電點為5.93。同時，將克隆得到的ack基因在E.coli中異源表達。以獲得的序列為基礎(chǔ)，采用pET-22b構(gòu)建了以氯霉素抗性基因為報告基因的乙酸激酶基因置換型基因敲除載體，其中長臂長1700bp，短臂長690bp。
　　利用簡并引物PCR和cassettePCR技術(shù)相結(jié)合的方法克隆了

6、控制乙醇生成的乙醇脫氫酶（adh）、乙醛乙醇脫氫酶（adhE）和氧化還原轉(zhuǎn)錄抑制因子Rex（Rex）基因。AdhE和Rex基因DNA片段長3747bp長，其在GenBank上的注冊號為DQ179103。Adh基因DNA片段長1902bp，其在GenBank上的注冊號為EU196512。AdhE編碼區(qū)DNA長2616bp，編碼871aa，編碼蛋白的分子量為95.47kD，理論等電點為6.16。Rex編碼區(qū)DNA長657bp，編碼218aa