納豆芽孢桿菌rocG和ure基因分析及敲除載體的構(gòu)建.pdf

1、納豆是日本的傳統(tǒng)食品,由納豆芽孢桿菌(Bacillus subtilis natto)發(fā)酵大豆而成,具有較高的營養(yǎng)價(jià)值和保健功能。但在納豆的發(fā)酵過程中,納豆芽孢桿菌代謝產(chǎn)生大量的氨,影響了其風(fēng)味。本課題組從商品納豆中分離得到納豆芽孢桿菌CGMCC No.2801,其發(fā)酵的納豆產(chǎn)品中氨含量達(dá)347.7±24.31mg/kg。改造納豆芽孢桿菌的代謝途徑可以有效地改善納豆的風(fēng)味。納豆芽孢桿菌代謝產(chǎn)氨的主要途徑是轉(zhuǎn)氨作用和谷氨酸脫氫酶(GDH)

2、催化的聯(lián)合脫氨基作用以及尿素酶催化的尿素降解作用。在納豆芽孢桿菌中,rocG基因和ure基因分別編碼GDH和尿素酶。因此,利用基因工程技術(shù),對GDH和尿素酶的編碼基因進(jìn)行敲除或定點(diǎn)突變,應(yīng)是解決這一問題的有效途徑。
　　本研究以B. subtilis168序列設(shè)計(jì)特異性引物,以分離株CGMCC No.2801為模板,PCR克隆了rocG和ure基因。對比CGMCC No.2801及9株芽孢桿菌屬菌株rocG基因和ure基因編碼區(qū)的

3、GC含量、GDH和尿素酶的氨基酸序列可知,這兩種酶在基因水平和氨基酸水平上均表現(xiàn)出較高的同源性和保守性,說明了rocG和ure基因在編碼合成GDH和尿素酶時(shí),穩(wěn)定性較高,只有在基因水平上進(jìn)行改造才能改變或降低酶活,因此定點(diǎn)突變或基因敲除應(yīng)是合理的降低產(chǎn)氨量的方案之一?；趓ocG基因和ure基因堿基序列構(gòu)建進(jìn)化樹,分析其親緣關(guān)系可知, CGMCC No.2801的GDH和尿素酶在進(jìn)化上更接近于枯草芽孢桿菌,且與B.subtilis168

4、的同源性最高,故選擇完成全基因組測序的B. sbutilis168為參考菌株,獲得分離株rocG和ure基因的非編碼區(qū)序列及敲除載體的上下游同源臂。NCBI比對及Mega5.05非編碼區(qū)序列分析結(jié)果顯示, CGMCC No.2801的rocG基因和ure基因的啟動(dòng)序列分別與原核微生物常見的-35區(qū)和-10區(qū)啟動(dòng)序列以及枯草芽孢桿菌σA啟動(dòng)序列基本相符。-35區(qū)和-10區(qū)啟動(dòng)序列以及枯草芽孢桿菌σA啟動(dòng)序列均為強(qiáng)啟序列,可推測這兩個(gè)基因的

5、轉(zhuǎn)錄效率較高,因而納豆芽孢桿菌可能在較短的時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生大量的GDH和尿素酶,催化產(chǎn)氨反應(yīng)。分析了革蘭氏陽性菌基因組整合質(zhì)粒pMUTin4的多克隆位點(diǎn)(MCS)及rocG基因和ure基因上下游1,000bp旁鄰序列的酶切位點(diǎn),確定了可用于重組質(zhì)粒構(gòu)建的4個(gè)酶切位點(diǎn),分別為HindⅢ(AAGCTT),XhoⅠ(CTCGAG),NotⅠ(GCGGCCGC)和BamHⅠ(GGATCC)。分別根據(jù)B. subtilis168的序列和已報(bào)道的nisI

6、基因的序列,設(shè)計(jì)特異性引物,并引入上述酶切位點(diǎn)。通過PCR方法,分別獲得了抗性篩選基因nisI片段和2個(gè)靶基因的上下游旁鄰片段。經(jīng)多次酶切酶連,將上游旁鄰片段、nisI和下游旁鄰片段按次序克隆至pMUTin4中。限制性內(nèi)切酶酶切圖譜及測序結(jié)果顯示成功構(gòu)建了納豆芽孢桿菌rocG基因和ure基因的敲除載體pMUTin4-rocG::nisI和pMUTin4-ure::nisI。通過同源重組,該敲除載體可用于構(gòu)建rocG基因和ure基因缺失型