芽孢桿菌產(chǎn)抗菌脂肽合成酶基因檢測及基因敲除研究.pdf

1、抗菌脂肽類化合物主要是芽孢桿菌通過生物合成途徑合成的一類低分子量代謝產(chǎn)物。隨著分子生物學(xué)研究手段的不斷進(jìn)步，人類已經(jīng)逐漸了解并掌握脂肽類化合物生物合成的規(guī)律。大多數(shù)脂肽類化合物的合成都是由非核糖體肽合成酶（Non-ribosomal peptide synthase，NRPS）基因簇調(diào)控。本研究首先確定脂肽類化合物NRPS生物合成過程的編碼基因，以實(shí)驗(yàn)室保藏的11株枯草芽孢桿菌、淀粉液化芽孢桿菌以及多粘類芽孢桿菌作為研究對象，通過分子克

2、隆技術(shù)對其編碼基因進(jìn)行檢測，并輔以高效液相檢測（High performance liquid eharomatography, HPLC）進(jìn)行驗(yàn)證，從而推測芽孢桿菌生物合成抗菌脂肽類化合物的潛在能力?；谝陨鲜侄?，我們建立了一種抗菌脂肽產(chǎn)生菌快速識別、篩選和抗菌脂肽快速鑒定的方法。
　　另一方面，NRPS的模塊化結(jié)構(gòu)和非常規(guī)線性化裝配模式?jīng)Q定了其終產(chǎn)物結(jié)構(gòu)的多樣性和活性的豐富性。本研究利用組合生物合成技術(shù)，對實(shí)驗(yàn)室保藏的一株P(guān)l

3、ipastatin產(chǎn)生菌Bacillus subtilis PB2進(jìn)行分子改造，分別對其具有底物選擇專一性的ppsC-A2結(jié)構(gòu)域、具有完整功能的ppsC-Glu模塊以及獨(dú)立酶活性的ppsC亞基結(jié)構(gòu)進(jìn)行敲除，構(gòu)建RPS雜合酶系，探索新型脂肽類化合物的形成，并探究結(jié)構(gòu)域、模塊與亞基的缺失對誘導(dǎo)出現(xiàn)NRPS模塊跳躍現(xiàn)象的影響及相互關(guān)系。然后針對出現(xiàn)模塊跳躍現(xiàn)象的ppsC-A2結(jié)構(gòu)域敲除菌株上下游ppsC-C2結(jié)構(gòu)域和ppsC-PCP2結(jié)構(gòu)域進(jìn)

4、行敲除，研究各個結(jié)構(gòu)域及模塊間的相互作用和聯(lián)系，進(jìn)一步探究脂肽類化合物模塊跳躍現(xiàn)象的出現(xiàn)與復(fù)合酶系調(diào)控生物合成傳遞間的關(guān)系。
　　主要研究結(jié)果如下:
　　1.基于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)（Polymerase chain reaction，PCR）和HPLC檢測技術(shù)建立了一種抗菌脂肽產(chǎn)生菌快速識別、篩選方法。通過擴(kuò)增抗菌脂肽類化合物合成酶編碼基因與脂肽類化合物HPLC檢測，證實(shí)了枯草芽孢桿菌、淀粉液化芽孢桿菌以及多粘類芽孢桿菌均具

5、有多種抗菌脂肽合成酶編碼基因（如sfp、srfAA、srfAD、fenA、fenB、fenD、ituD、ituA、ituB、albF、albA、pmxB、pmxC、pmxE、bmyA、bmyB、bmyC），推測它們均具有合成多種抗菌脂肽類化合物的潛力(如Surfactin、Fengyein、Iturin、Bacillomycin D、SubtilosinA、Polymyxin)。但是某些脂肽類化合物因合成產(chǎn)量過低或合成過程受阻而未被HP

6、LC檢測發(fā)現(xiàn)，其具體原因有待研究?；驒z測結(jié)果同樣證實(shí)了不同種屬的菌株具有不同或相同的抗菌脂肽類化合物合成酶編碼基因，而同一種細(xì)菌的不同菌株之間具有的抗菌脂肽類化合物合成酶編碼基因也不盡相同。因此，該技術(shù)同樣可以運(yùn)用于尋找不同種屬細(xì)菌之間的同源性基因。
　　2.利用組合生物合成策略構(gòu)ppsC-A2結(jié)構(gòu)域、ppsC-Glu模塊、ppsC亞基敲除菌株。通過重疊延伸PCR（Splicing by overlap extension PC

7、R, SOE-PCR）獲得敲除位點(diǎn)上、下游基因融合片段，成功構(gòu)建了枯草芽孢桿菌敲除載體。將敲除載體轉(zhuǎn)入B.subtilisPB2感受態(tài)細(xì)胞中，誘導(dǎo)無標(biāo)記同源重組敲除，獲得兩步單交換成功的重組敲除菌株。對敲除菌株進(jìn)行HPLC分析，ppsC-A2結(jié)構(gòu)域敲除菌株P(guān)lipastatin生物合成過程出現(xiàn)模塊跳躍現(xiàn)象，并在其發(fā)酵液中發(fā)現(xiàn)一種新型抗菌脂肽類似物。經(jīng)高分辨率質(zhì)譜（High-resolution mass spectrometry, HR

8、-ESI-MS）與二級質(zhì)譜（Tandem massspectrometry, MS/MS）分析，確定該物質(zhì)為缺少第六模塊丙氨酸（Alanine，Ala）的Plipastatin線性類似物。ppsC-Glu模塊敲除菌株和psC亞基敲除菌株P(guān)lipastatin合成過程受阻，合成釋放Plipastatin能力明顯下降。同時兩株重組菌株未出現(xiàn)模塊跳躍現(xiàn)象，未發(fā)現(xiàn)有新型抗菌脂肽類化合物產(chǎn)生。
　　3.利用無標(biāo)記同源重組方法構(gòu)建ppsC-C