馬鈴薯塊莖GWD基因的克隆及其表達(dá)載體的構(gòu)建.pdf

1、在高等植物中，淀粉是一種主要的能量?jī)?chǔ)存物質(zhì)，它是繼纖維素之后的最豐富的碳水化合物，是人類(lèi)飲食的主要能源物質(zhì)。同時(shí)淀粉作為一種可生物降解的具有優(yōu)良化學(xué)性狀的高聚物，是一種有巨大開(kāi)發(fā)潛力、應(yīng)用廣泛的可再生資源。植物體內(nèi)淀粉上的唯一取代就是淀粉磷酸化，被高度磷酸化作用的磷酸酯淀粉，擁有一些獨(dú)特的性能，事實(shí)上，淀粉磷酸化作用機(jī)制是最近幾年才有一些突破性的進(jìn)展。α-葡聚糖水合激酶(GWD)是淀粉磷酸化作用酶，在淀粉代謝中起了關(guān)鍵的作用，它的豐度直

2、接影響到磷酸酯淀粉的含量。因此，圍繞α-葡聚糖水合激酶進(jìn)行基因工程操作具有重要的實(shí)際意義。本文主要是在馬鈴薯GWD基因克隆、測(cè)序、鑒定以及其表達(dá)載體的構(gòu)建方面展開(kāi)了一些工作。主要的研究結(jié)果如下： 1．利用改進(jìn)的TRizol法，提取馬鈴薯塊莖中的總RNA。由于馬鈴薯塊莖中富含多酚、多糖、多蛋白等干擾因素，所以提取過(guò)程中采用β一巰基乙醇、PVP、高濃度NaCl、低濃度乙醇等的綜合處理，消除這些干擾因素，最后能提取完整的高純度的總RN

3、A。 2．根據(jù)馬鈴薯基因組數(shù)據(jù)庫(kù)提供的序列信息設(shè)計(jì)引物，利用：RT-PCR從馬鈴薯塊莖中擴(kuò)增GWD基因。擴(kuò)增過(guò)程中，先分段擴(kuò)增GWDl、GWD2片段，再以此初級(jí)PCR產(chǎn)物為模板，連接擴(kuò)增成完整的GWD基因。通過(guò)對(duì)PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)合冷、熱啟動(dòng)PCR和降落式PCR技術(shù)，最終從馬鈴薯塊莖中分離出長(zhǎng)達(dá)4.4 kb的GWD基因片段。 3．將GWD基因克隆到pTA2載體上，獲得重組質(zhì)粒，經(jīng)測(cè)序分析與公開(kāi)發(fā)表的數(shù)