家蠶Bm8K蛋白的分離純化及功能初探.pdf

1、在脊椎動物和無脊椎動物中，Insulin/IGFs信號系統(tǒng)調(diào)控生物個體的生長發(fā)育和代謝。這個系統(tǒng)的效應(yīng)因子具有保守性，特別是胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白(IGFBPs)家族的N端和C端結(jié)構(gòu)域序列高度保守。其對細胞的增殖、分化和凋亡都起著至關(guān)重要的作用。Insulin/IGFs系統(tǒng)是當今生物領(lǐng)域的研究熱點，其不管是在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)還是在疾病治療方面，都具備有著廣闊的應(yīng)用前景。
　　 家蠶作為鱗翅目昆蟲的模式生物，不僅具有重要的經(jīng)濟價值，同時

2、也為其它昆蟲的研究提供重要的參考。而目前對無脊椎動物IGFBPs的功能同系物少有報道。本論文主要對家蠶Bm8K蛋白進行生物信息學(xué)分析，分離純化Bm8K蛋白，對其功能進行初步研究。主要結(jié)果如下：
　　 1.家蠶Bm8K基因的生物信息學(xué)分析
　　 根據(jù)Bm8K基因組序列，預(yù)測它出其由2個外顯子和1個內(nèi)含子構(gòu)成，其中內(nèi)含子的長度為578bp，2個外顯子的長度分別為193bp和110bp。通過TESS網(wǎng)站預(yù)測出以轉(zhuǎn)錄起始位點(+

3、1)上游的2500bp區(qū)域中有34個可能的胰島素信號系統(tǒng)相關(guān)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件。用在線ProtParam軟件分析，預(yù)測出Bm8K蛋白有5對二硫鍵，成熟肽的分子量約為8694Da，等電點為8.64。通過對Bm8K蛋白的氨基酸序列BLAST比對發(fā)現(xiàn)其與胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白(IGFBPs)的序列具有相似性，特別與IGFBPs的N端功能區(qū)域匹配程度較高。
　　 2.家蠶8K蛋白的分離純化及鑒定
　　 為了獲取天然的Bm8K蛋白，

4、將五齡三天的家蠶血液蛋白通過硫酸銨沉淀法，凝膠過濾層析和離子交換層析純化蛋白。利用MALDI-TOF質(zhì)譜和Western blotting對純化得到的蛋白進行鑒定，結(jié)果表明純化得到的蛋白為單一的Bm8K蛋白。
　　 3.家蠶的加糖飼料喂養(yǎng)對Bm8K基因的表達影響
　　 從四齡開始對家蠶用添加了15％的葡萄糖的人工飼料喂養(yǎng)后，提取五齡三天家蠶脂肪體和頭的RNA，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，以其為模板對Bm8K基因和Bombyxin

5、A3基因進行PCR擴增，分析檢測它們的表達情況。結(jié)果表明，加糖飼料喂養(yǎng)家蠶使Bm8K基因和BombyxinA3基因都得到上調(diào)表達。
　　 4.Bm8K蛋白對家蠶卵巢細胞生長情況的影響
　　 用不同濃度(25、50、100μg/mL)的Bm8K蛋白處理對數(shù)穩(wěn)定生長期的卵巢細胞，對照組用等量的PBS處理，培養(yǎng)48h后，用Cell Counting Kit-8對卵巢細胞的生長情況進行檢測。結(jié)果表明，Bm8K蛋白能夠促進家蠶卵巢