去乙?；窼irt3對腸上皮屏障功能的作用研究.pdf

1、背景及目的:
　　腸黏膜屏障是機體防御的重要屏障,多種急慢性病理條件誘發(fā)腸粘膜屏障功能(IBF)損傷的共同機制可能是腸粘膜缺氧,各種手術(shù)應(yīng)激、創(chuàng)傷等病理條件都會導(dǎo)致腸道的局部缺氧,進而破壞緊密連接蛋白(TJs),影響該屏障的功能。而在這一過程中缺氧誘導(dǎo)因子-1α(HIF-1α)起著重要作用。去乙?；窼irt3是煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)依賴型的組蛋白去乙?；讣易宓闹匾蓡T之一。其在能量代謝、基因沉默、DNA損傷修復(fù)、有絲

2、分裂調(diào)控及抗凋亡等方面起著重要的作用。而有關(guān)缺氧條件下去乙酰化酶Sirt3能否調(diào)控缺氧誘導(dǎo)因子,減輕腸屏障功能受損的報道目前尚少。我們采用RNA干擾(RNAi)技術(shù)及對腸上皮細胞的缺氧處理,觀察Sirt3對缺氧誘導(dǎo)因子-1α及腸屏障功能的影響。緊密連接是構(gòu)成腸道黏膜機械屏障上皮細胞的重要結(jié)構(gòu),可防止腸道有害物質(zhì)侵入腸黏膜組織,維持腸上皮的通透性和細胞的極性。腸粘膜屏障功能調(diào)控與腸粘膜局部的缺氧密切相關(guān)。
　　目前研究已表明在諸如感

3、染性休克、內(nèi)毒血癥、缺血再灌注、炎癥性腸病等多種急慢性病理情況下,都會發(fā)生腸粘膜的局部缺氧,這種粘膜缺氧又會與炎癥反應(yīng)協(xié)同作用,而大量炎癥因子也會加劇缺氧造成的腸粘膜屏障功能損傷造成細菌和(或)內(nèi)毒素入血引發(fā)腸源性感染、全身性炎癥反應(yīng)、MODS等,而缺氧誘導(dǎo)因子是這一過程的重要調(diào)節(jié)因子,部分HIF-1α缺失可以減輕腸道缺血缺氧造成的損傷。
　　Sirtuins或沉默信息調(diào)節(jié)蛋白2(Silencing information reg

4、ulator2, S-ir2)類似酶是一個煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)依賴型的組蛋白去乙?；傅募易?Sirt3屬于該家族的成員之一。目前大量研究證明,Sirt3在慢性損傷過程中發(fā)揮著重要作用,尤其是Sirt3可以抑制與腫瘤發(fā)生相關(guān)的瓦博格效應(yīng),從而減少腫瘤的突變概率。
　　HIF-1α作為與缺氧狀態(tài)密切相關(guān)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子,擔負著重要的腸粘膜屏障調(diào)節(jié)者的角色。為此,在本實驗中我們采用RNA干擾技術(shù)首先驗證Sirt3對HIF-1

5、α是否有調(diào)控作用。由于 Sirt3在腸道中相對較少,我們在實驗中對其在常氧狀態(tài)下蛋白和mRNA表達水平進行了檢測,從而確保了實驗的可行性。在研究中發(fā)現(xiàn)Sirt3在常氧與缺氧的不同時段表達并無明顯差異。在常氧+Sirt3-siRNA組蛋白幾乎沒有表達,說明干擾效果較好;在缺氧+Sirt3-siRNA組Sirt3蛋白仍有表達,這可能與干擾效率相關(guān)。而HIF-1α在缺氧6h表達最明顯,這與我們前期的研究結(jié)論一致。同時HIF-1α蛋白表達升高時

6、,mRNA在常氧和低氧條件下變化不明顯,這與文獻報道的其在食管癌與膀胱癌中的變化相符。由于HIF-1α是一個具有中樞性意義的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子,可以通過多個通路作用于緊密連接蛋白來執(zhí)行應(yīng)激和病理條件下的腸粘膜屏障調(diào)節(jié)機制,因此我們也對緊密連接蛋白及腸屏障功能的變化進行了研究。
　　研究方法:
　　1.細胞培養(yǎng):Caco-2細胞在37℃、5％co2、飽和濕度條件下用含20%胎牛血清MEM培養(yǎng)基培養(yǎng),用0.25%胰酶消化傳代。

7、　　2.細胞轉(zhuǎn)染:細胞接種至六孔板后,當細胞密度達到30%-50%時,各取5μl/孔Lipofectamine2000、Sirt3-siRNA用250μl Opti-MEM I Reduced Serum Medium稀釋,室溫孵育5min;將兩者混合室溫靜置20min,然后加入含細胞的孔中,放入37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6h后將培養(yǎng)基換為含血清的完全培養(yǎng)基。3.細胞分組及處理:待細胞培養(yǎng)96h后,將細胞的培養(yǎng)基更換為1ml不含胎牛血清的MEM

8、培養(yǎng)液,分別行常氧處理(正常對照組Nx、常氧+Sirt3-siRNA組)、缺氧6h處理(1%O2 Hx組,缺氧6h+Sirt3-siRNA組)。將細胞置于37℃培養(yǎng)箱中,不間斷通入含有體積分數(shù)為:1%O2,5%co2的混合氣體培養(yǎng)6h。
　　4.RNA的提取及RT-PCR:細胞缺氧6h后,使用冷鹽酸緩沖液(PBS)漂洗3次,每孔中加入Trizol,按照Trizol說明書提取總RNA。總RNA定量后取1μg按照PrimeScript

9、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進行逆轉(zhuǎn)錄,體系為20μl,合成 CDNA。RT-PCR擴增條件:955min,9445s,58℃30s,72℃45s,共30個循環(huán),最后72℃延伸10min。取8μl PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳(110v,35min),采用Kodak Molecular Imaging軟件分析相對定量。
　　5.蛋白提取與Western blot檢測:使用PBS將缺氧6h后的細胞漂洗3次,每孔中加入預(yù)冷混有10μl的苯甲基磺酰氟(

10、PMSF)的 RIPA裂解液100μl,冰上放置30min,12000xg4℃離心15min。使用蛋白測定試劑盒測定上清液蛋白含量。蛋白上樣后70V電泳,蛋白跑過上層膠后,改為100V電泳1.5h;200v恒流濕轉(zhuǎn)2h至PVDF膜,轉(zhuǎn)膜后使用50g/l的脫脂奶粉封閉2h,加入 Sirt3、Occludin、Claudin-1、Zo-1、HIF-1α、GAPDH一抗后4℃冰箱過夜。TBST洗膜3次,每次10min。將化學(xué)發(fā)光試劑均勻滴加在

11、目的蛋白上,使用圖像分析系統(tǒng)采集發(fā)光信號后,再通過 Kodak Molecular Imaging軟件進行密度分析,將其與甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)的灰度比值當作目的蛋白的表達量。
　　6.腸上皮細胞跨上皮電阻(TER)測定:Caco-2細胞以2×105個/孔接種于Transwell小室微孔膜上培養(yǎng),每日定時更換培養(yǎng)基,測定細胞 TER,當測定的值達到穩(wěn)定后(4d),進行實驗處理。處理分為4組(具體分組同上),每個處理組

12、取3個孔,重復(fù)實驗3次。TER值按照原始數(shù)值減去空白對照數(shù)值(Rcell monolayer=Rsample-Rblank)表示,結(jié)果表示為處理后的值占處理前的百分比。
　　7.統(tǒng)計學(xué)方法:應(yīng)用 SPSS13.0統(tǒng)計軟件分析,結(jié)果均以均數(shù)±標準差(`x±s)表示,組間比較采用單因素方差分析,兩兩比較采用t檢驗。
　　研究結(jié)果:
　　1、Sirt3與HIF-1α蛋白表達變化。Western blot分析Sirt3和HIF

13、-1α不同處理組的變化:Nx+Sirt3-siRNA組Sirt3蛋白表達較Nx組下降52%; Hx+Sirt3-siRNA組Sirt3蛋白表達較Hx組下降35%。Nx+Sirt3-siRNA組HIF-1α蛋白表達升高(0.72±0.01),較Nx組上升約89.5%,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.01); Hx+Sirt3-siRNA組 HIF-1α蛋白表達升高(0.93±0.01),較Hx組升高約14.8%,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.01)

14、。。
　　2、腸上皮細胞TJs的蛋白水平的變化:采用Western blot法,檢測2%O2 Hx組和缺氧6h+Sirt3-siRNA組蛋白的變化,分別與常氧組及常氧+Sirt3-siRNA組進行比較, TJs選用 ZO-1、Occludin、Claudin-1,此3種分子在缺氧+Sirt3-siRNA組的蛋白水平(0.72±0.02、0.71±0.03、0.69±0.01)較Hx組下降22%、20%、12%差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p<

15、0.01)而常氧+Sirt3-siRNA組TJs的蛋白水平與Nx組蛋白表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義(p>0.05)。
　　3、腸上皮細胞 TJs的 mRNA水平的變化:采用 RT-PCR法,檢測2%O2 Hx組和缺氧6h+Sirt3-siRNA組mRNA的變化,分別與常氧組進行比較。ZO-1、Occludin、Claudin-1的mRNA在缺氧+Sirt3-siRNA組的水平(0.88±0.03、0.80±0.01、0.84±0.01)較

16、 Hx組下降約22%、40%、28%差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.01)。較Nx組下降42%、62%、32%,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.01)。而常氧+Sirt3-siRNA組TJs的mRNA水平與Nx組表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義(p>0.05)。
　　4、腸上皮電阻的變化:Nx+Sirt3-siRNA組 TER值與 Nx組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(p>0.05),而 Hx+Sirt3-siRNA組TER下降明顯(36.17±3.81)%較Hx組(

17、52.26±2.68)%下降30.8%,與常氧對照組(102.58±2.31)%比較下降64.7%,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.01),證明沉默 Sirt3,可使腸上皮TER降低,造成腸上皮通透性不穩(wěn)定。
　　結(jié)論:
　　1. SIRT3調(diào)節(jié)HIF1α穩(wěn)定。常氧與缺氧條件下Sirt3的表達變化無明顯差異,而在缺氧條件下HIF-1α表達比常氧條件下明顯升高,其中缺氧六小時表達最高。在缺氧條件下(6H)沉默Sirt3,發(fā)現(xiàn)HIF-