Sirt1去乙?；疦rf2對百草枯暴露小鼠肺泡Ⅱ型上皮細胞的保護作用.pdf

1、目的:提取小鼠AECⅡ細胞，建立原代AECⅡ細胞PQ中毒模型，并觀察Sirt1、Nrf2表達量的改變與PQ作用的劑量、時間效應(yīng)關(guān)系，探求兩者之間的聯(lián)系。觀察Nrf2蛋白的乙酰化水平、穩(wěn)定性與Sirt1表達的關(guān)系，觀察Nrf2與ARE的結(jié)合活性改變與PQ作用的劑量、時間效應(yīng)關(guān)系。觀察不同劑量、不同時間PQ作用后，細胞氧化應(yīng)激指標的改變及細胞凋亡的改變。
　　方法:
　　1.低濃度胰酶聯(lián)合Ⅰ型膠原酶消化法提取小鼠AECⅡ細胞，臺

2、盼藍染色檢測細胞活力，免疫熒光鑒定所提取細胞
　　2.以PCR、Western Blot、Co-IP方法檢測不同劑量(400μM、800μM、1200μM、1600μM作用24h)、不同時間（800μ M作用6h、12h、24h、48h）PQ作用后小鼠AECⅡ細胞Sirt1、Nrf2基因和蛋白水平表達的改變及Nrf2乙?；降淖兓珽MSA法檢測不同劑量、不同時間PQ作用后小鼠AEC-Ⅱ Nrf2與ARE結(jié)合活性的改變，應(yīng)用放線

3、菌酮檢測Nrf2蛋白穩(wěn)定性的改變。
　　3.化學(xué)比色法檢測不同劑量(400μ M、800μ M、1200μ M、1600μ M作用24h)、不同時間（800μ M作用6h、12h、24h、48h）PQ作用后小鼠AEC-Ⅱ氧化應(yīng)激指標SOD、CAT、GSH、MDA的改變，ELISA法檢測不同劑量、不同時間PQ作用后小鼠AEC-ⅡHO-1的表達改變，caspase-3、caspase-9活性試劑盒檢測不同劑量、不同時間PQ作用后小鼠A

4、EC-Ⅱcaspase-3、caspase-9活力的改變，流式細胞計數(shù)檢測不同劑量、不同時間PQ作用后小鼠AEC-Ⅱ凋亡比例的改變，Western Blot檢測不同劑量、不同時間PQ作用后小鼠AEC-ⅡCytochrome c蛋白表達改變。
　　結(jié)果:
　　1.經(jīng)低濃度胰酶聯(lián)合Ⅰ型膠原酶消化法分離、純化小鼠AECⅡ，每只小鼠可平均獲得5×106個細胞，臺盼藍染色證實細胞活力90％，免疫熒光特異性蛋白染色證實所提取細胞為小鼠A

5、ECⅡ。
　　2.不同時間、不同劑量PQ作用后Sirt1、Nrf2的基因及蛋白水平的變化保持一致，均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，分別在12h、800μM時表達達到高峰，與對照組相比均有顯著性差異(P＜0.05)。Nrf2的乙?；脚cSirt1蛋白的表達水平呈現(xiàn)相反趨勢。不同時間、不同劑量PQ作用后Nrf2與ARE的結(jié)合活性同樣呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，分別在24h、800μM時結(jié)合活性達到峰值，與對照組相比均有顯著性差異(P＜0.05

6、)。穩(wěn)定性結(jié)果顯示，Sirt1的存在，增加了Nrf2的穩(wěn)定表達。
　　3.PQ作用后抗氧化酶SOD、CAT的活力及抗氧化物GSH的含量隨作用時間延長先降低而后回升;隨著PQ作用劑量的加大，抗氧化酶SOD、CAT的活力及抗氧化物GSH的含量先下降后有所回升更大劑量后再次下降，與對照組相比均有顯著性差異(P＜0.05)。HO-1的表達則隨著PQ作用濃度的增大遞增，隨作用時間延長先升高后降低，與對照組相比均有顯著性差異(P＜0.05)。

7、PQ作用后，MDA含量呈現(xiàn)時間、劑量依賴性增加，與對照組相比均有顯著性差異(P＜0.05)。caspase-3、caspase-9的活力隨PQ作用時間延長、劑量加大呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，與對照組相比均有顯著性差異(P＜0.05)。PQ作用后細胞凋亡隨時間、劑量的增加而增多，但長時間、大劑量作用后，細胞死亡數(shù)超過凋亡數(shù)。線粒體內(nèi)Cytochrome c蛋白呈現(xiàn)時間、劑量依賴性降低，胞質(zhì)中其含量與細胞凋亡趨勢一致。
　　結(jié)論:

8、>　　1.PQ作用于小鼠AEC-Ⅱ后，Sirt1表達量升高，通過其去乙酰化作用于Nrf2，降低了Nrf2的乙?；?，使得Nrf2蛋白的表達量升高，同時使其穩(wěn)定性增強。
　　2.PQ作用于小鼠AEC-Ⅱ后能夠激活線粒體調(diào)控的細胞凋亡途徑，使細胞凋亡增多，凋亡蛋白表達升高，脂質(zhì)過氧化損傷加重。PQ作用后Nrf2在細胞內(nèi)表達量升高、穩(wěn)定性增強，并且與ARE特異性結(jié)合的能力增強，繼而調(diào)節(jié)位于下游的抗氧化物HO-1、SOD、CAT、GSH