羅漢果遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立與CS基因的轉(zhuǎn)化研究.pdf

1、羅漢果（Siraitia grosvenorii）為我國特有的藥用和甜料經(jīng)濟(jì)作物，其果實(shí)中的有效成分甜苷Ⅴ(MogrosidesⅤ)是世界上甜度最高的非糖甜味物質(zhì)之一。葫蘆二烯醇酶(Cucurbitadienol Synthase，CS)是甜苷Ⅴ生物合成的關(guān)鍵酶，利用基因工程技術(shù)，構(gòu)建CS基因過表達(dá)載體，通過根癌農(nóng)桿菌的介導(dǎo)將其轉(zhuǎn)入羅漢果中，將是提高甜苷Ⅴ含量的一種途徑。羅漢果雌、雄異株，后代群體中雌株比例小，因而大量雄株浪費(fèi)土地和資金

2、;且種質(zhì)資源匱乏，傳統(tǒng)雜交育種困難。本文研究以羅漢果雌株組培苗真葉為外植體，優(yōu)化了葉片離體再生體系;以正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)為方法，通過根癌農(nóng)桿菌的介導(dǎo)將CS基因過表達(dá)載體轉(zhuǎn)入羅漢果中，建立了羅漢果遺傳轉(zhuǎn)化體系，為羅漢果轉(zhuǎn)基因育種提供了科學(xué)依據(jù)。研究結(jié)果如下:
　　1、羅漢果無菌苗壯苗的最佳激素組合為0.3 mg/L的6-BA和0.05 mg/L的IBA，株高達(dá)7.67 cm，新增葉片數(shù)為4.90張/株，最大葉面積達(dá)8.00 cm2。

3、>　　2、葉片誘導(dǎo)的最佳激素組合為0.7 mg/L的TDZ和0.2 mg/L的IBA，出愈時間為12.7天，出愈率達(dá)89.43％，誘導(dǎo)出的愈傷組織大小為0.73cm。
　　3、愈傷組織誘導(dǎo)芽分化的最佳6-BA濃度為0.5mg/L，分化率達(dá)73.33％，平均芽數(shù)4.11個/塊;
　　4、遺傳轉(zhuǎn)化中最佳的Km篩選濃度為10 mg/L;
　　5、葉片遺傳轉(zhuǎn)化的最佳Cef抑菌濃度為300 mg/L;
　　6、愈傷組織遺傳

4、轉(zhuǎn)化的最佳Cef抑菌濃度為600 mg/L;
　　7、葉片遺傳轉(zhuǎn)化研究中，正交試驗(yàn)結(jié)果的最優(yōu)組合為(A2B2C1D3)，即葉片最佳預(yù)培養(yǎng)時間為1天，最適農(nóng)桿菌菌液濃度為OD600=0.5，最適侵染時間為5 min，最佳共培養(yǎng)時間為3天。用延遲篩選的方式篩選抗性再生苗，經(jīng)PCR鑒定抗性苗224株，獲得了3株轉(zhuǎn)CS基因過表達(dá)載體的陽性植株，總轉(zhuǎn)化率為1.34％;
　　8、愈傷組織遺傳轉(zhuǎn)化中未檢測到陽性植株。但根據(jù)除轉(zhuǎn)化率外的其他