siRNA抑制TAK1基因?qū)A滑膜細胞Aggrecanase-1表達的影響.pdf

1、目的
　　 代培養(yǎng)RA(rheumatoid arthritis;類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎)滑膜細胞,獲取高純度滑膜成纖維細胞,轉(zhuǎn)特異性的siRNA染入RA滑膜成纖維細胞內(nèi),給予炎性刺激因素干預(yù),探討是否能降低RA滑膜成纖維細胞Aggrecanase-1表達水平,及siRNA技術(shù)在RA基因治療中的可行性。
　　 方法
　　 收集類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎病人膝關(guān)節(jié)置換術(shù)中病變的類風(fēng)濕性滑膜組織,采用酶消化法進行體外滑膜細胞的分離培養(yǎng)并傳

2、至3-5代,倒置顯微鏡下觀察細胞生長狀態(tài),通過免疫組化鑒定。定制siRNA轉(zhuǎn)染試劑及轉(zhuǎn)染誘導(dǎo)劑,制備可靠的特異性siRNA,將RA滑膜成纖維細胞分為四組,分別為轉(zhuǎn)染TAK1-siRNA細胞組(實驗組),錯配堿基陰性轉(zhuǎn)染對照細胞組、GAPDH-siRNA陽性對照組和未轉(zhuǎn)染細胞組(對照組)。轉(zhuǎn)染后對各組進行IL-1β干預(yù),收集各組細胞上清液,ELISA方法比較各組Aggrecanase-1(聚蛋白多糖酶-1)的釋放量。
　　 結(jié)果<

3、br>　　 該實驗4例患者的滑膜細胞標本均采用體外消化培養(yǎng)法成功培養(yǎng),平均傳代至3～5代,細胞生長狀態(tài)較好,比較穩(wěn)定,大約傳至第7代時細胞生長減慢,出現(xiàn)老化狀態(tài)。免疫組化鑒定滑膜細胞均一地表達Vimetin(＞95%)、表明所培養(yǎng)的細胞是滑膜成纖維細胞。檢測炎性刺激后實驗組與對照組相比Aggrecanase-1含量有明顯的差異,呈現(xiàn)出組間差異,表明通過抑制TAK1可降低Aggrecanase-1表達水平,以降低對關(guān)節(jié)軟骨的損傷。