球孢白僵菌脯氨酸脫氫酶的生物學(xué)功能及多蛋白橋聯(lián)因子1介導(dǎo)菌體氧化耐受力的初步機(jī)制.pdf

1、球孢白僵菌(Beauveria bassiana)是絲孢類(lèi)害蟲(chóng)生物防治真菌，寄主范圍極廣，因而已被開(kāi)發(fā)成多種制劑用于害蟲(chóng)生物防治。本文主要研究了球孢白僵菌脯氨酸脫氫酶BbPDH在真菌生長(zhǎng)發(fā)育中的功能。同時(shí)還對(duì)多蛋白橋聯(lián)因子1(BbMBF1)調(diào)節(jié)的抗氧化路徑進(jìn)行了探究。
　　球孢白僵菌BbPDH功能研究首先，構(gòu)建單基因敲除株和回補(bǔ)株，并以此為基礎(chǔ)開(kāi)展表型實(shí)驗(yàn)和生化分析。綠色熒光蛋白和MitoTraker熒光染料共定位分析顯示，BbP

2、DH蛋白在細(xì)胞內(nèi)是定位在線粒體上的。BbPDH調(diào)控球孢白僵菌生長(zhǎng)發(fā)育和對(duì)熱脅迫的應(yīng)激響應(yīng)?；蚯贸?，除了△BbPDH2，其他的三個(gè)敲除菌株在薩氏培養(yǎng)基SDAY和察氏培養(yǎng)基CZA板上的生長(zhǎng)都受到了抑制。更換氮源后，這三個(gè)敲除株還是表現(xiàn)出生長(zhǎng)缺陷。當(dāng)用NH4Cl作為氮源，TCA循環(huán)中α-酮戊二酸、琥珀酸、檸檬酸、蘋(píng)果酸分別作為碳源時(shí)，△BbPDH1和△BbPDH4有恢復(fù)生長(zhǎng)的趨勢(shì)。而△BbPDH3的生長(zhǎng)速率相對(duì)野生株來(lái)說(shuō)還是下降的。熱激后

3、，野生株、△BbPDH2和△BbPDH3菌株的生長(zhǎng)速率分別下降了11.17％、11.83％和19.61％。但是△BbPDH1和△BbPDH4對(duì)熱脅迫更為敏感。分生孢子產(chǎn)量測(cè)定結(jié)果顯示△BbPDH2和△BbPDH3的分生孢子產(chǎn)量與野生株相比并無(wú)顯著差異，但△BbPDH1和△BbPDH4由于生長(zhǎng)速率變慢，產(chǎn)孢量會(huì)有一定程度的下降。△BbPDH1、△BbPDH2和△BbPDH3的芽孢產(chǎn)量和野生株相比并無(wú)明顯差異，而△BbPDH4芽孢產(chǎn)量下降明

4、顯。除△BbPDH2菌株芽孢大小沒(méi)有明顯改變，另外三個(gè)敲除株的芽生孢子均比野生株大。在萌發(fā)板上，各敲除株分生孢子活力均沒(méi)受到明顯影響。但在水瓊脂糖板上，△BbPDH1和△BbPDH4的孢子萌發(fā)率相對(duì)野生株顯著下降，△BbPDH3次之，△BbPDH2孢子萌發(fā)率與野生株相近。在對(duì)大蠟螟幼蟲(chóng)的生測(cè)實(shí)驗(yàn)中，除△BbPDH2，其他三個(gè)基因敲除株的毒力均呈顯著下降。由此可見(jiàn)，球孢白僵菌四個(gè)BbPDH基因在菌株生長(zhǎng)，耐熱及致病力方面發(fā)揮著不同的作用。

5、
　　BbMBF1對(duì)球孢白僵菌抗氧化路徑的調(diào)控多蛋白橋聯(lián)因子1(BbMBF1)，是一個(gè)進(jìn)化上高度保守的轉(zhuǎn)錄輔因子，在真核生物發(fā)育和抗逆方面扮演著重要角色。我們已經(jīng)證實(shí)，△BbMBF1在甲萘醌脅迫下生長(zhǎng)速率變緩，RT-PCR分析在氧化脅迫條件下野生株中該基因的表達(dá)量升高。為了進(jìn)一步探索BbMBF1在甲萘醌脅迫下調(diào)節(jié)的下游靶標(biāo)基因，我們比較了野生株和△BbMBF1的轉(zhuǎn)錄組。分析顯示，BbMBF1調(diào)節(jié)的氧化響應(yīng)基因在功能類(lèi)上主要富集在代

6、謝，細(xì)胞營(yíng)救和運(yùn)輸方面。更重要的是，生物信息分析預(yù)測(cè)了一個(gè)假定的基序，主要分布在與代謝和解毒相關(guān)的基因的啟動(dòng)子上。為了獲得與BbMBF1p特異性結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子，我們以提取的細(xì)胞核蛋白為樣品，進(jìn)行免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)，洗脫下來(lái)的蛋白通過(guò)質(zhì)譜分析，找到了轉(zhuǎn)錄因子BbAP-1。通過(guò)構(gòu)建基因敲除菌株，發(fā)現(xiàn)與野生株相比，敲除株在甲萘醌脅迫下生長(zhǎng)同樣受到抑制。綜上所述，這些結(jié)果表明球孢白僵菌的BbMBF1通過(guò)介導(dǎo)調(diào)節(jié)代謝和解毒路徑的潛在轉(zhuǎn)錄因子響應(yīng)氧化脅